斑馬魚模型在納米毒理學中的研究應(yīng)用與進展

鐘 健朱佳瑞何欣宇馬婧怡李睿祺張金波

(佳木斯大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江佳木斯 154007)

由于納米材料具有優(yōu)良的理化性質(zhì),越來越廣泛的被應(yīng)用到催化、材料、軍事、機械、電子、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。 納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢,在構(gòu)建藥物載體、藥物的控釋緩釋等方面擁有巨大的應(yīng)用前景。 隨著納米材料日益廣泛的應(yīng)用,人們接觸到納米材料的機會越來越多,對納米材料的生物安全性研究也越來越迫切。 目前,已有不少納米材料的毒理學研究[1-3],但許多納米材料的毒性效應(yīng)或體內(nèi)毒性機制仍不明確,納米材料的生物安全性需更進一步的研究和探討。

目前,已有諸多研究表明斑馬魚是納米毒理學較為理想的模式生物。 斑馬魚作為一種脊椎動物,與人類基因的相似度高達87%[4],其生理或藥理反應(yīng)與人類具有很高的相似性,所以其在毒理學的研究當中具有很強的說服力。 相比大鼠、小鼠,斑馬魚具有體外受精、胚胎在體外發(fā)育且透明易于觀察的優(yōu)勢,另外,其體型小易于飼養(yǎng),繁殖率高(成熟雌魚每次可產(chǎn)卵100～300 枚)為統(tǒng)計學計算提供了充足的樣本數(shù)量；發(fā)育速度快且不同的發(fā)育階段特征明顯,可在胚胎發(fā)育的不同階段做不同的毒理學實驗且試驗周期短。 所以斑馬魚是一種理想的毒理學模式生物,且已經(jīng)在胚胎發(fā)育毒理學和環(huán)境毒理學中得到了廣泛應(yīng)用[5-6]。 如今斑馬魚模型也愈來愈多的被應(yīng)用到納米毒理學的研究當中。

1 納米材料對斑馬魚的毒性作用

由于斑馬魚的基因與人類基因相似度極高,將斑馬魚作為模式生物進行納米毒理學研究具有很高的準確性和可信度。 在實驗中,納米材料對斑馬魚所造成的各方面毒性作用也更貼近人類,實驗結(jié)果對臨床實踐具有一定的指導(dǎo)意義。 研究表明,納米材料可對斑馬魚造成的毒性作用包括消化系統(tǒng)毒性、生殖系統(tǒng)毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、胚胎毒性等。

1.1 消化系統(tǒng)毒性

研究表明,引起消化系統(tǒng)的毒性損傷是納米材料最普遍的毒性效應(yīng)之一,納米材料進入斑馬魚體內(nèi)后,富集于肝和腸道最為多見,因此對肝和腸道的損傷也更為顯著。

1.1.1 腸道損傷

L?vmo 等[7]研究表明,納米顆粒作用于成年斑馬魚,經(jīng)口腔攝入并進入腸道,經(jīng)切片定位成像顯示,納米顆粒在腸道內(nèi)被迅速吸收,使腸道內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng),并轉(zhuǎn)移到肝和脾。 Sung 等[8]分別將30 nm 和80 nm 的納米金和銀(nano-Au/nano-Ag)作用于成年斑馬魚,顯示大部分納米粒子均在肝、腸、鰓組織中被攝取,其中大粒徑(80 nm)納米粒子在肝和腸道組織中積累分布,小粒徑(30 nm)納米粒子在鰓中被過濾而聚集。 而Osborne 等[9]關(guān)于納米粒子粒徑和分布關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)與Sung 正好相反,Osborne 等[9]將成年斑馬魚分別暴露于兩種不同粒徑(20 nm、110 nm)檸檬酸鈉包被的nano-Ag,研究顯示,在20 nm 粒徑組的斑馬魚腸道中基底外側(cè)膜可觀察到明顯的納米粒子沉積,在110 nm 粒徑組則未觀察到明顯沉積。 Osborne 等[9]認為 nano-Ag 在腸道基底外側(cè)膜沉積的機制與腸道基底外側(cè)膜上的Na+/K+離子通道的破壞和ATP 酶活性降低有關(guān)。 說明粒徑大小和在器官分布的關(guān)系并非絕對,其分布的影響還與其他因素相關(guān)。 Chen 等[10]將濃度為100 μg/L 的納米氧化鈦(nano-TiO2)作用于成年斑馬魚,研究顯示,nano-TiO2可影響腸道神經(jīng)調(diào)節(jié)、增加腸上皮屏障滲透性、引起炎癥和氧化應(yīng)激等。 另外nano-TiO2的長期暴露會引起斑馬魚腸道內(nèi)菌群失調(diào),造成損傷。 Kang 等[11]將濃度為(0.156、0.313、0.625、1.25、2.5 mg/mL)的碳量子點(C-QDs)溶液通過浸泡法作用于斑馬魚胚胎,實驗表明,C-QDs 主要聚集在斑馬魚胚胎的頭部、腸道和尾巴,其中腸道的聚集最為顯著。 經(jīng)染毒的斑馬魚胚胎在純水中靜置24 h 后,低濃度組(0.156、0.313、0.625 mg/mL)的C-QDs 已完全清除出體外,僅在高濃度組(1.25、2.5 mg/mL)中有少量殘留并伴有腸道輕微損傷,48 h 后,所有實驗組斑馬魚胚胎腸道內(nèi)的C-QDs 均已消除。 說明在腸道內(nèi)富集的C-QDs 可完全經(jīng)代謝清除,但高濃度處理時仍會對腸道造成輕微損傷。 雖然目前關(guān)于納米粒子在腸道內(nèi)分布情況和影響其分布或毒性損傷的機制尚不明確,但已有充分證據(jù)說明腸道是納米粒子的毒性靶器官之一。

1.1.2 肝損傷

肝是機體內(nèi)重要的解毒器官,也是納米粒子最易發(fā)生富集的部位之一。 在眾多研究中,納米粒子在肝當中聚集可破壞肝結(jié)構(gòu)、影響肝功能。 Ren等[12]將 0.9 mg/L 的 nano-TiO2連續(xù) 21 d 作用于成年斑馬魚,發(fā)現(xiàn)nano-TiO2在斑馬魚體內(nèi)呈富集狀態(tài),主要集中分布于大腦、性腺和肝,其中肝的含量最高,其次是大腦和性腺。 段延芳[13]將6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料(鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+, Er3+)作用于受精后 24 h(hours post-fertilization,hpf)的斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,以上三種納米材料均易富集在心臟和肝,其中對于肝的毒性損傷最為顯著,可引起肝發(fā)育畸形；引起肝細胞水腫、壞死。 染毒濃度越大,引起的肝損傷越嚴重。 Souza 等[14]將成年斑馬魚分別暴露于三種濃度(2、10、20 mg/L)的氧化石墨烯(GO)中,研究顯示,GO 可使肝細胞出現(xiàn)核碎裂、核固縮、形成液泡、細胞破裂和壞死,作用濃度越高,肝細胞損傷越顯著。Gao 等[15]發(fā)現(xiàn)暴露于納米二氧化錳(nano-MnO2)的成年斑馬魚肝細胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄功能障礙,α 淀粉酶、羧酸酯水解酶、羧肽酶等代謝酶類合成受到抑制,使肝功能受損。 劉林等[16]將成年斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.05、0.1、5、10、25、50 mg/L)的納米氧化鋅(nano-ZnO)中分別處理4 h、24 h、96 h,結(jié)果顯示肝細胞出現(xiàn)水腫、氣球樣變,核固縮；肝巨噬細胞數(shù)量顯著增加；丙二醛(MDA)含量增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性增強,但過氧化氫酶(CAT)活性下降；基因Bax/Bcl-2 比值、p53 表達水平上調(diào)。 說明nano-ZnO 能引起肝細胞變性壞死、引起氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)細胞凋亡,使斑馬魚肝嚴重損傷。 以上研究表明,納米材料可以在肝當中大量聚集,并能引起組織和功能損傷,肝中的各種酶活性發(fā)生變化和基因表達的改變是引起肝損傷的主要原因。

1.2 生殖系統(tǒng)毒性

眾多研究指出,性腺也是納米材料易于富集的臟器,納米材料可對斑馬魚的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用。 Fang 等[17]將濃度為 100 μg/L 的 nano-TiO2作用于成年斑馬魚(雌雄各半),研究顯示,nano-TiO2被吸收后可轉(zhuǎn)移聚集到性腺,使斑馬魚血漿雌二醇(E2)、睪酮(T)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)濃度降低,卵黃原蛋白(VTG)濃度顯著升高。雖然在nano-TiO2作用下,斑馬魚的卵巢和睪丸并未出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變,但各種激素水平不同程度改變導(dǎo)致了內(nèi)分泌的失調(diào)和生殖障礙。 Kotil 等[18]將成年斑馬魚暴露于三種濃度(1、2、4 mg/L)的nano-TiO2,取斑馬魚睪丸組織檢測,結(jié)果表明,nano-TiO2可使斑馬魚睪丸間質(zhì)細胞和精原細胞有絲分裂紊亂,伴有細胞變性,在睪丸間質(zhì)細胞可見自噬泡大量聚集。 隨著nano-TiO2處理濃度增加,細胞和組織損傷也越嚴重,引起間質(zhì)細胞、生精細胞、精原細胞的細胞自噬、壞死,造成生殖毒性。 以上研究說明納米粒子可以通過改變斑馬魚各激素水平或直接對性腺造成組織損傷,從而對生殖系統(tǒng)造成毒性影響。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)毒性

研究表明,腦是納米粒子易于聚集的器官之一,納米材料可對斑馬魚腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷。 Sheng 等[19]將成年斑馬魚暴露于5 種濃度(5、10、20、40 μg/L)的 nano-TiO245 d,研究顯示nano-TiO2可使斑馬魚去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺的水平顯著降低,NO 水平顯著升高,膠質(zhì)細胞過度增殖,神經(jīng)元凋亡,同時nano-TiO2能顯著激活原癌基因 C-fos、C-jun、BDNF 基因表達,抑制p38、NGF、CREB、NR1、NR2ab、GluR2 基因表達。 說明nano-TiO2可對斑馬魚的神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷。Wu 等[20]將魚齡4 個月的斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.5、4、32 μg/L)的 nano-TiO2中,結(jié)果顯示,出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成和腦室增大等明顯的腦損傷。nano-TiO2引起的腦損傷機制主要引起了腦內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生,腦內(nèi) MAD、SOD、GSH 活性降低,使腦組織傾向與發(fā)生氧化應(yīng)激,造成了斑馬魚大腦的嚴重損傷,并出現(xiàn)游泳和社會行為異常。 以上研究說明腦是納米粒子的毒性靶器官之一,可對神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷,并引起功能障礙。

1.4 胚胎毒性

研究表明,納米材料可引起斑馬魚胚胎顯著的毒性損傷,影響斑馬魚胚胎正常發(fā)育、引起不同程度的畸形。 Kang 等[11]分別將(0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL)的C-QDs 溶液作用于斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,(0.5、1.0、1.5 mg/mL)組的胚胎存活率均高于80%,略低于對照組存活率95%,而2.5 mg/mL 組的存活率僅為55%。 說明C-QDs 在低濃度作用下,毒性較小。 段延芳[13]將 6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+, Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+, Er3+)分別作用于24 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,隨作用劑量的增大,斑馬魚胚胎的畸形率隨之增加。 其引起的畸形主要有:魚鰾發(fā)育緩慢或異常、脊柱彎曲、肝畸形、心包囊水腫、卵黃囊異常。 其中以魚鰾發(fā)育緩慢及肝畸形最為常見。 Ahmad 等[21]將平均粒徑為40 nm 的CoFe2O4納米粒子(nano-CoFe2O4)作用于斑馬魚胚胎(96 hpf),觀察發(fā)現(xiàn),能引起斑馬魚胚胎嚴重心臟水腫、代謝下調(diào)、孵化延遲、尾巴/脊髓彎曲,另外nano- CoFe2O4的聚集和離子溶解對胚胎細胞膜造成嚴重的機械損傷和氧化應(yīng)激,其中頭部、心臟、尾部細胞最為顯著。 李翔[22]將斑馬魚受精卵暴露于兩種不同粒徑(15 nm、50 nm)濃度范圍在(50-1000 μg/mL)的納米二氧化硅(nano-SiO2),結(jié)果顯示經(jīng)兩種粒徑處理后受精卵的孵化率都出現(xiàn)降低、死亡率和畸形率均顯著增加,且隨納米粒子處理濃度的增高,畸形率升高的越顯著。 其中在100 μg/mL 濃度處理時,受精卵畸形率高達60%,并出現(xiàn)輕微心包水腫,當處理濃度大于300 μg/mL時,受精卵畸形率大于95%。 隨處理濃度的增加,畸形程度越嚴重,其中畸形的種類包括:心包水腫(PE),卵黃膜畸形(YM),脊柱彎曲(BS),小頭(SH),小眼(SE),尾部畸形(TM),發(fā)育不良(SG)。Choi 等[23]將96 hpf 的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的(0.01、0.1、1、10 mg/L)nano-ZnO 中,研究發(fā)現(xiàn)心包水腫和卵黃囊水腫是nano-ZnO 所導(dǎo)致的主要畸形,使用微陣列的基因表達譜顯示在暴露于nano-ZnO 后,689 個基因中有 498 個上調(diào),191 個下調(diào)。所以其至畸原因可能與斑馬魚基因上調(diào)、下調(diào)密切相關(guān)。 Ong 等[24]將斑馬魚受精卵暴露于多種納米粒子(納米硅(nano-Si)、納米銀(nano-Ag)、納米氧化鋅(nano-ZnO)、納米硒化鎘(nano-CdSe)、單壁碳納米管(SWCNT)),研究顯示暴露于10 mg/L nano-Ag 和 nano-CdSe 可延遲斑馬魚孵化,100 mg/L nano-CdSe 以及 10 mg/L 和 100 mg/L nano-ZnO 可完全抑制孵化,使胚胎在絨毛膜內(nèi)死亡。 經(jīng)研究證實,抑制斑馬魚孵化的是納米粒子本身,而非其金屬溶解成分。 以上研究表明,納米粒子可對斑馬魚胚胎造成較顯著的毒性作用。 另外,斑馬魚胚胎對于納米粒子的毒性十分敏感、效應(yīng)顯著,是納米毒理學研究的理想模型。

2 納米材料對斑馬魚造成毒性的作用機制

為使納米材料在日益廣泛的研究和應(yīng)用中具有安全性,勢必要清楚其對機體的毒性機制。 但納米粒子對機體的毒性機制研究尚不充分,目前,眾多以斑馬魚為模型研究納米粒子毒性機制的研究表明,發(fā)生氧化應(yīng)激、細胞凋亡、基因表達改變、細胞周期改變是納米粒子引起斑馬魚毒性的主要機制。

2.1 氧化應(yīng)激

已有研究表明,納米粒子引起機體細胞最主要、最顯著的毒性影響即引起氧化應(yīng)激。 Xiong等[25]分別將50 mg/L 納米二氧化鈦(nano-TiO2)和5 mg/L 納米氧化鋅(nano-ZnO)作用于成年斑馬魚,結(jié)果表明nano-TiO2和nano-ZnO 可使斑馬魚鰓、消化道、肝的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)發(fā)生不同程度的改變,使機體發(fā)生氧化應(yīng)激。 Shih等[26]將金紅型 nano-TiO2染毒斑馬魚成魚,表明nano-TiO2使斑馬魚鰓和肝組織的SOD 活性顯著降低,發(fā)生氧化應(yīng)激,造成鰓、肝的氧化損傷。 高悅[27]將斑馬魚尾鰭傷口暴露于平均粒徑為10 nm 的經(jīng)檸檬酸鈉包被的納米銀顆粒(nano-Ag),發(fā)現(xiàn)活性氧(reactive oxygen species,ROS)在暴露的尾鰭傷口細胞大量產(chǎn)生,引起氧化應(yīng)激,中性粒細胞超過正常水平約50%,使再生尾鰭增殖細胞顯著減少,凋亡細胞增多,造成毒性作用。 Wu 等[20]將魚齡4 個月的斑馬魚暴露于不同濃度(0、0.5、4、32 μg/L)的納米TiO2中,發(fā)現(xiàn)能使斑馬魚腦內(nèi)的ROS 大量生成,同時腦內(nèi)MAD、SOD、GSH 等含量均出現(xiàn)變化,證實腦組織發(fā)生氧化應(yīng)激,造成斑馬魚腦組織損傷。Zhu 等[28]將受精后2 h(hours post-fertilization, hpf)的斑馬魚胚胎分別暴露于粒徑為15 和30 nm 的納米二氧化硅(nano-SiO2),用三種濃度(25、50、100 mg/L)分別處理5 d,結(jié)果表明,粒徑越小、濃度越大的nano-SiO2對斑馬魚胚胎體內(nèi)的ROS 含量影響越大,引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激也越嚴重。 以上研究表明,不同的納米粒子均可以造成斑馬魚發(fā)生氧化應(yīng)激,引起毒性作用。

2.2 細胞凋亡

細胞凋亡是一種為維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)而主動發(fā)生的細胞程序性死亡,許多研究表明納米粒子可引起斑馬魚細胞凋亡,造成機體的毒性損傷。 Du 等[29]將斑馬魚胚胎暴露于不同濃度(0、12.5、25、50 mg/L)的nano-ZnO 溶液中,隨著處理濃度的升高,斑馬魚胚胎體內(nèi)的 SOD、 谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)和Caspase-9 酶的活性顯著升高,CAT 酶活性被抑制,同時,細胞凋亡相關(guān)基因:Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,BAX)、腫瘤抑制基因P53、B 淋巴細胞瘤-2 基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達改變,斑馬魚胚胎氧化損傷并引起細胞凋亡。 馬爽[30]將nano-SiO2作用于斑馬魚胚胎,研究顯示SiO2可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(BIP)、蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、磷酸化真核細胞起始因子2α(e-IF2α)表達,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；細胞凋亡和抗細胞凋亡相關(guān)基因BAX、BID、Bcl-2、Mcl-1b表達量改變,引起細胞凋亡,造成斑馬魚胚胎的毒性損傷。Zhao 等[31]使用 5 種濃度(10、30、60、90、120 mg/L)的nano-ZnO 處理斑馬魚胚胎,顯示nano-ZnO 可使促凋亡基因(Bax、Puma、Apaf-1)上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2 下調(diào),且凋亡細胞的百分率呈劑量依賴性增加(0.41% ～4.21%)。 另外,斑馬魚胚胎細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)發(fā)生變化,以及 Caspases-9 和 Caspases-3 被激活,說明nano-ZnO 可激活線粒體通路引起細胞凋亡,引起斑馬魚胚胎細胞毒性作用。 已有研究表明,線粒體是納米材料生物毒性的主要作用靶點,所以線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路是納米粒子引起細胞凋亡的主要途徑之一[32]。 Gao 等[33]將斑馬魚胚胎暴露于粒徑為50 nm 的nano-Ag 當中,顯示可干擾氧在胚胎血管細胞內(nèi)的擴散,造成細胞缺氧,同時引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并造成胚胎血管上皮細胞凋亡,影響斑馬魚胚胎血管的發(fā)育。 Zhou 等[34]使用聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米膠束(PEG-b-PCL)作用于斑馬魚胚胎,結(jié)果顯示,能引起p53 基因上調(diào),血管生成區(qū)細胞促凋亡通路被激活,抑制血管生成,對斑馬魚胚胎心血管發(fā)育具有毒性作用。 綜上所述,納米粒子可通過引起細胞氧化應(yīng)激、改變酶的活性、影響基因表達、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路或線粒體途徑引起細胞凋亡,造成斑馬魚毒性損傷。

2.3 影響基因表達

目前有研究表明,斑馬魚體內(nèi)基因的表達情況會受納米粒子影響,對斑馬魚造成毒性損傷。 Gao等[33]將50 nm 的nano-Ag 作用于斑馬魚胚胎,研究顯示,nano-Ag 可抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路基因表達,使酪氨酸激酶(Src)受抑制,磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)通路中Akt 磷酸化,抑制血管生成,導(dǎo)致斑馬魚胚胎血管發(fā)育的異常遲緩,造成胚胎發(fā)育毒性。 Ladhar 等[35]將斑馬魚暴露于粒徑為8 nm 和50 nm 的硫化鎘納米顆粒(CdSNPs)中,隨機擴增多態(tài)性 DNA 標記(random amplified polymorphic DNA,RAPD)PCR 基因毒性試驗結(jié)果顯示CdSNPs 可使RAPD 探針的雜交位點數(shù)量明顯改變,即基因組發(fā)生改變,引起線粒體功能障礙。 Du 等[29]將斑馬魚胚胎暴露于三種濃度(12.5、25、50 mg/L)的 nano-ZnO 中,結(jié)果表明Bax、p53、Caspase-3、Caspase-9 等凋亡通路相關(guān)基因均出現(xiàn)顯著上調(diào),而抗凋亡基因Bcl-2 顯著下調(diào),引起斑馬魚胚胎出現(xiàn)嚴重的細胞凋亡,造成顯著的胚胎毒性。 Sheng 等[19]將四種濃度(5,10、20、40 μg/L)的nano-TiO2連續(xù)45 d 作用于成年斑馬魚,結(jié)果顯示,nano-TiO2可顯著激活C-fos、C-jun、Bdnf基因表達,抑制p38、Ngf、Creb、Nr1、NR2ab、GluR2 基因表達,對斑馬魚大腦產(chǎn)生一定程度的損傷,具有神經(jīng)毒性。以上研究表明,納米材料影響斑馬魚基因的表達是納米材料引起斑馬魚毒性損傷的重要機制之一。

2.4 細胞周期

近年來有研究研表明,納米粒子可以通過影響斑馬魚細胞周期,影響斑馬魚的生長發(fā)育。 Hou等[36]將 nano-ZnO 作用于斑馬魚胚胎,研究發(fā)現(xiàn),nano-ZnO 可抑制細胞周期蛋白(Cycs)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的表達,使微脂質(zhì)體(MCM)被破壞,激活了 Cyc/CDK 復(fù)合物(CycD/CDK4,6；CycE/CDK2；CycA/CDK2),使細胞周期的不同時期(G1 期、M 期和 G2 期)均受到影響,導(dǎo)致 DNA 復(fù)制紊亂,個體的細胞分裂、分化、增殖等正?；顒蛹癉NA 合成和細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移功能受到干擾,造成一定程度的細胞毒性作用。

3 納米材料對斑馬魚的毒性影響因素

有研究表明,納米粒子的化學組成、粒徑、濃度或劑量、形狀、給藥方式以及納米材料的制備方法等,都可以影響納米材料對機體的毒性。

3.1 化學組成

Xiong 等[25]將兩種粒徑相同(50 nm)而化學組成不同的納米粒子(nano-TiO2、nano-ZnO)作用于成年斑馬魚(作用濃度為5 mg/L、50 mg/L),檢測斑馬魚在鰓、消化道及肝的各項指標(SOD、CAT、GSH、MDA),表明5 mg/L 的nano-ZnO 對斑馬魚的毒性作用要顯著強于5 mg/L nano-TiO2,另外5 mg/L 的nano-ZnO 和50 mg/L 的nano-TiO2對斑馬魚的毒性效應(yīng)幾乎相當,說明在相同粒徑、相同濃度下,nano-ZnO 的毒性要顯著大于 nano-TiO2。 Liu 等[37]分別將200 μg/mL 的 SiO2納米球和 C-QDs 作用于6 hpf的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明SiO2納米球會引起胚胎嚴重的畸形,而經(jīng)C-QDs 處理的斑馬魚胚胎則能夠正常發(fā)育,其畸形率與對照組基本相同。 因此,C-QDs較SiO2納米球的致畸毒性小。

3.2 濃度或劑量

Zhu 等[28]將三種不同濃度(25、50、100 mg/L)的nano-SiO2作用于2 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,nano-SiO2濃度越大,對斑馬魚胚胎體內(nèi)的ROS 含量影響越大,引起斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激也越嚴重。 Souza 等[14]將成年斑馬魚分別暴露于三種濃度(2、10、20 mg/L)的氧化石墨烯(GO)中,研究顯示,GO 可使肝細胞出現(xiàn)核碎裂、核固縮、形成液泡、細胞破裂和壞死,作用濃度越高,肝細胞損傷越顯著。段延芳[13]將 6 種濃度(0、25、50、200、400 μg/mL)的三種上轉(zhuǎn)換納米材料(鉺離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Er3+)、銩離子與鐿離子相摻的四氟釔鈉(NaYF4:Yb3+,Tm3+)、鉺離子與鐿離子相摻的四氟釓鈉(NaGdF4:Yb3+,Er3+)分別作用于24 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明,其半數(shù)致死量為200 μg/mL,隨作用濃度的增大,斑馬魚胚胎的畸形率和死亡率都隨之增加。

3.3 粒徑

通常情況下,粒徑越小的納米粒子毒性越強。Zhu 等[28]將兩種不同粒徑(15 nm,30 nm)的nano-SiO2作用2 hpf 的斑馬魚胚胎,結(jié)果表明nano-SiO2粒徑越小,聚集在斑馬魚胚胎內(nèi)的納米粒子就越多,排出的時間也越長,毒性效應(yīng)越顯著。 李翔[22]將斑馬魚受精卵暴露于兩種不同粒徑(15 nm、50 nm)濃度范圍在(50～1000 μg/mL)的納米二氧化硅(nano-SiO2),研究顯示,在處理濃度相同時,15 nm(小粒徑組)的nano-SiO2更易被機體攝取,富集含量更多,造成的毒性影響也更顯著,斑馬魚受精卵的死亡率和畸形率也顯著增加。

3.4 形狀

Hua 等[38]將不同形狀的nano-ZnO(納米球、納米棒、亞微米立方體型)作用于斑馬魚胚胎,研究表明,不同形狀的nano-ZnO 可造成不同程度的胚胎毒性,其中納米棒的毒性作用最強,其機制可能為納米棒結(jié)構(gòu)尖而細,對生物膜有較強的損傷和破壞能力,且可以延長其在機體內(nèi)分布時間,難以代謝排除,對機體造成較強毒性作用。 Ispas 等[39]將樹枝狀和球形的納米Ni 作用于斑馬魚,經(jīng)對比發(fā)現(xiàn),樹枝狀的納米Ni 在斑馬魚體內(nèi)的停留時間要遠長于球形納米Ni,使樹枝狀納米Ni 在體內(nèi)分布的量更多,其毒性效應(yīng)也越顯著,對斑馬魚的腸道和骨骼肌造成嚴重的組織損傷。

3.5 給藥方式

Kang 等[11]分別將(0.5、1.0、1.5、2.5 mg/mL)的C-QDs 溶液通過微注射法和浸泡法作用于斑馬魚胚胎。 實驗表明,通過微注射法和浸泡法給藥的(0.5、1.0、1.5 mg/mL)組的胚胎存活率均超過80%,通過浸泡法給藥的2.5 mg/mL 組存活率為60%,而通過微注射法給藥的2.5 mg/mL 組存活率僅為55%。 說明,在相同的作用劑量下,微注射法比浸泡法對斑馬魚胚胎有更強的毒性損傷。

3.6 制備方法

Peng 等[40]分別將將自頂向下法和自底向上法合成的碳點(C-dots)通過微注射法作用于受精后6 d 的斑馬魚胚胎腹腔。 結(jié)果顯示,自頂向下法合成的C-dots 可在斑馬魚骨骼中大量沉積,即對鈣化骨具有極好的親和力。 而自底向上法合成的C-dots則并不能再骨骼中觀察到,即無骨親和特性。 自頂向下法合成的C-dots 與斑馬魚骨骼良好的親和性可能與其制備過程中表面產(chǎn)生的大量極性基團有關(guān)。

綜上所述,通常情況下,在其他變量都相同時:粒徑越小的納米粒子毒性越強；濃度或劑量越大毒性越強；不同化學組成的納米粒子性質(zhì)差異較大,如不含金屬的納米材料(如碳量子點等)較含金屬或金屬氧化物的納米粒子毒性小,引起的毒性效應(yīng)和毒性機制不甚相同；不同形狀的納米粒子也可能具有不同的毒性機制；納米材料制備方法的差異抑或是給藥方式的差異都可導(dǎo)致不同的體內(nèi)效應(yīng)。但目前對于納米粒子毒性機制的研究尚不深入,影響納米粒子毒性的因素依然有待探討。

4 結(jié)語

目前,斑馬魚作為毒理學研究的重要模式生物,已經(jīng)在環(huán)境毒理學、胚胎發(fā)育毒理學當中得到了十分廣泛的研究和應(yīng)用,因其具備的許多哺乳動物所沒有的獨特優(yōu)勢,斑馬魚在納米毒理學中日益受到各國專家學者的重視。 當前大部分關(guān)于斑馬魚的納米毒理學研究主要集中在毒性機制(如氧化應(yīng)激、細胞凋亡、基因表達改變等)和毒性效應(yīng)(如對消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的損傷),但由于大部分研究仍然停留在表面,而且不全面、不徹底,人們對納米粒子的毒性機制和影響毒性因素依然所知甚微。 未來,納米粒子使斑馬魚各個系統(tǒng)損傷的發(fā)生損傷的具體分子機制是一個重要的研究方向[41-42],另外,如何降低納米粒子的毒性作用、對納米粒子的安全粒徑、濃度或劑量范圍的尋找依舊需要不斷研究探索,為納米粒子在臨床應(yīng)用打下重要基礎(chǔ)。