水稻種子活力性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析研究進(jìn)展

楊 彬，周嘉潤，沈玉婷，孫曼嘉，呂 凡，黃偉聰，鄭奕雄，萬小榮

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院/廣州市特色作物種質(zhì)資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510225)

水稻直播栽培技術(shù)因其具有節(jié)省勞力、成本低和易于規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，近年來在我國得到大量的推廣[1]。然而，直播稻生產(chǎn)上常面臨種子發(fā)芽或成苗不整齊、幼苗長勢(shì)差等問題，嚴(yán)重影響了水稻產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。種子是農(nóng)業(yè)最基本也是最關(guān)鍵的生產(chǎn)資料，高質(zhì)量種子對(duì)于保障糧食生產(chǎn)尤為重要[1]。種子活力是評(píng)鑒種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1-2]。種子活力是指種子在田間條件下具備快速萌發(fā)、整齊發(fā)芽及發(fā)育成健壯幼苗的潛力[3-4]。水稻直播栽培技術(shù)對(duì)種子活力這一重要播種性狀具有較高的要求，需要選用在不同脅迫條件下仍具有高種子活力的水稻品種[5]。因此，挖掘種子活力相關(guān)基因并解析其遺傳調(diào)控機(jī)制，對(duì)今后選育適合直播的高活力水稻品種具有重要意義。

1 水稻種子活力的衡量指標(biāo)

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，水稻種子活力常用的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括種子萌發(fā)期相關(guān)性狀、幼苗早期生長相關(guān)性狀、逆境抗性相關(guān)性狀及生理生化相關(guān)性狀等4類。研究人員通過鑒定得以上指標(biāo)，基于連鎖分析的方法鑒定到大量的水稻種子活力相關(guān)數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci，QTLs)。

1.1 種子萌發(fā)期相關(guān)性狀

種子萌發(fā)期相關(guān)性狀包括發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、成苗率、胚根長及胚芽長等。例如，Wang等以粳稻大關(guān)稻、秈稻IR28及其構(gòu)建的150個(gè)重組自交系(recombinant inbred lines，RILs)為試驗(yàn)材料，通過鑒定萌發(fā)3 d的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)，定位到10個(gè)種子活力相關(guān)QTLs[6]；Liu等以粳稻韭菜青、秈稻IR26及其構(gòu)建的150個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，分別在不同發(fā)育階段(抽穗后38、42 d)收獲種子，并鑒定種子在3 d的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)，定位到33個(gè)種子活力相關(guān)QTLs[7]；Xie等以秈稻珍汕97、明恢63及其構(gòu)建的120個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定萌發(fā)2 d和3 d的胚根長和胚芽長等指標(biāo)，定位到8個(gè)種子活力相關(guān)QTLs[8]；Dimaano等以雜草稻W(wǎng)TR-1、秈稻Y-134及其構(gòu)建的167個(gè)BC1F5群體為試驗(yàn)材料，通過調(diào)查萌發(fā)2 d和7 d的發(fā)芽率等指標(biāo)，定位到43個(gè)種子活力相關(guān)QTLs[9]。

1.2 幼苗早期生長相關(guān)性狀

幼苗早期生長相關(guān)性狀包括芽長、根長、苗長(高)、胚芽鞘長、中胚軸長、芽鮮/干質(zhì)量、根鮮/干質(zhì)量及苗鮮/干質(zhì)量等。例如，Abe等以粳稻Kakehashi、Dunghan Shali及其構(gòu)建的250個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過考察萌發(fā)14 d的苗高，檢測(cè)到4個(gè)幼苗活力相關(guān)QTLs[10]；Zhang等以秈稻93-11、PA64s及其構(gòu)建的132個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定萌發(fā)15 d的芽長、根長、苗鮮質(zhì)量和苗干質(zhì)量等指標(biāo)，定位到65個(gè)幼苗活力相關(guān)QTLs[11]；Singh等以秈稻Swarna、粳稻Moroberekan及其342個(gè)回交3代子3代(BC3F4)為試驗(yàn)材料，通過鑒定8 d和20 d的苗高、根長、根鮮質(zhì)量和芽鮮質(zhì)量等指標(biāo)，檢測(cè)到6個(gè)幼苗活力相關(guān)QTLs[12]；Xu等以秈稻CG133R、粳稻Javanica22及其構(gòu)建的166個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定萌發(fā)5、10、15、20、25 d的苗高、根長、根鮮質(zhì)量和芽鮮質(zhì)量等指標(biāo)，對(duì)多個(gè)幼苗活力連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行表型驗(yàn)證與位點(diǎn)組合分析[13]。

1.3 逆境抗性相關(guān)性狀

逆境抗性相關(guān)性狀包括逆境條件下種子萌發(fā)期相關(guān)性狀、幼苗早期生長相關(guān)性狀及成活率等。例如，Wang等以粳稻韭菜青、秈稻IR26及其構(gòu)建的150個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定鹽脅迫條件下 5 d 和10 d的發(fā)芽率等指標(biāo)，定位到16個(gè)萌發(fā)期耐鹽相關(guān)QTLs[14]；Liu等利用秈稻GC2、粳稻IL112及其構(gòu)建的F2∶3群體，通過鑒定低溫脅迫條件下幼苗的成活率，檢測(cè)到7個(gè)幼苗耐冷相關(guān)QTLs[15]；Jiang等以粳稻沈農(nóng)625、麗江新團(tuán)黑谷及其構(gòu)建的144個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定低溫脅迫條件下6 d的發(fā)芽率，檢測(cè)到11個(gè)低溫發(fā)芽相關(guān)QTLs[16]；Najeeb等以雜草稻W(wǎng)TR-1、毫安弄及其構(gòu)建的230個(gè)近交系(introgression lines，ILs)為試驗(yàn)材料，通過鑒定低溫脅迫條件下2、4、6 d的發(fā)芽率及10、13、16 d 的根長和芽長等指標(biāo)，定位到27個(gè)低溫發(fā)芽相關(guān)QTLs[17]；Jahan等以秈稻Basmati、Pokkali及其構(gòu)建的129個(gè)F3為試驗(yàn)材料，通過鑒定鋁脅迫條件下發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、根長、芽長及活力指數(shù)等指標(biāo)，檢測(cè)到46個(gè)萌發(fā)期和幼苗期耐鋁相關(guān)QTLs[18]。

1.4 生理生化相關(guān)性狀

生理生化相關(guān)性狀包括α-淀粉酶活性、還原糖含量、根系活力和葉綠素含量等。例如，Cui等以秈稻珍汕97、明恢63及其構(gòu)建的241個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過測(cè)定α-淀粉酶活性、還原糖含量和根系活力等指標(biāo)，定位到14個(gè)幼苗活力相關(guān)QTLs[19]；同時(shí)，崔克輝等利用上述同一套材料測(cè)定了葉綠素a含量和總?cè)~綠素含量，定位到3個(gè)幼苗活力相關(guān)QTLs[20]。

2 GWAS研究概述

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)是近些年用于解析動(dòng)植物復(fù)雜數(shù)量性狀的一種常見方法。GWAS是基于海量的單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNPs)標(biāo)記，以連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)為基礎(chǔ)，在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)地研究群體特定性狀與SNPs之間關(guān)聯(lián)的手段[21]。

2.1 GWAS研究的優(yōu)點(diǎn)

相較于傳統(tǒng)的連鎖分析，GWAS具有諸多優(yōu)勢(shì)[22-23]。第一，連鎖定位需要通過雙親進(jìn)行多代雜交構(gòu)建出分離群體，研究的時(shí)間和人力成本高，而GWAS所利用的自然變異群體，研究周期大幅度降低；第二，連鎖定位所用的分子標(biāo)記在全基因組范圍內(nèi)密度小、分辨率低，初定位檢測(cè)出的QTLs區(qū)間較大，而基于高密度SNPs的GWAS能快速實(shí)現(xiàn)精細(xì)定位；第三，連鎖分析只能檢測(cè)到每個(gè)基因座上最多的2個(gè)等位變異類型，而GWAS能鑒定到群體內(nèi)同一位點(diǎn)上所有的等位變異類型[24]。

2.2 GWAS研究的技術(shù)路線

GWAS研究的流程一般包括下述6個(gè)步驟[25]。(1)關(guān)聯(lián)群體種質(zhì)資源收集：選擇的群體需具備一定的數(shù)量，具有廣泛的遺傳多樣性，這對(duì)后續(xù)的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)檢測(cè)至關(guān)重要；(2)關(guān)聯(lián)群體SNPs分型：SNPs是在動(dòng)植物基因組上廣泛存在的遺傳變異，是GWAS研究中最常使用的分子標(biāo)記，一般利用基因芯片技術(shù)和重測(cè)序技術(shù)對(duì)關(guān)聯(lián)群體SNPs進(jìn)行分型；(3)群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系評(píng)價(jià)：由于關(guān)聯(lián)群體內(nèi)可能含有多個(gè)亞群，亞群間的等位基因型頻率存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的GWAS出現(xiàn)假陽性位點(diǎn)，通過群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析可降低假陽性率；(4)GWAS：結(jié)合基因型數(shù)據(jù)和表型數(shù)據(jù)，選擇合適的關(guān)聯(lián)分析模型，如一般線性模型(general linear model，GLM)、混合線性模型(mixed linear model，MLM)等進(jìn)行GWAS，檢測(cè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)；(5)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的候選基因篩選：根據(jù)LD衰減距離，劃定顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的候選基因所在基因組區(qū)域，進(jìn)一步利用基因注釋、同源基因分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)表達(dá)譜數(shù)據(jù)和單倍型分析篩選獲得關(guān)鍵候選基因；(6)基因功能驗(yàn)證：利用構(gòu)建的基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系、基因干涉轉(zhuǎn)基因株系、基因點(diǎn)突變株系和差異單倍型轉(zhuǎn)基因回補(bǔ)株系對(duì)關(guān)鍵候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。

3 水稻種子活力GWAS研究進(jìn)展

近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的更新迭代，測(cè)序成本逐漸降低，GWAS廣泛應(yīng)用于解析水稻表型多樣性遺傳變異基礎(chǔ)。目前，GWAS已在水稻種子活力相關(guān)基因的挖掘方面取得一定的研究進(jìn)展。

3.1 種子萌發(fā)期相關(guān)性狀和幼苗早期生長相關(guān)性狀GWAS

Wang等通過鑒定307個(gè)水稻品種第14天的側(cè)根數(shù)、根長和芽長等性狀，利用GWAS檢測(cè)到6個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并通過基因表達(dá)分析和測(cè)序比較分析對(duì)位于11號(hào)染色體上的位點(diǎn)qTIPS-11進(jìn)行候選基因篩選，明確1個(gè)編碼糖基水解酶的基因?yàn)樵撐稽c(diǎn)的關(guān)鍵候選基因，命名為Tips-11-9；進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)插入突變體進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Tips-11-9突變體的根系活力顯著低于野生型[26]。Guo等通過鑒定200個(gè)水稻品種萌發(fā)2 d的發(fā)芽率及7 d的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等性狀，利用GWAS檢測(cè)到19個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，其中有6個(gè)位點(diǎn)與前人報(bào)道的種子活力相關(guān)QTLs共定位；此外該研究以粳稻02428和秈稻YZX構(gòu)建的192個(gè)RILs為試驗(yàn)材料，通過鑒定上述4個(gè)性狀，利用連鎖分析定位到12個(gè)QTLs，其中有7個(gè)位點(diǎn)與前人報(bào)道的種子活力相關(guān)QTLs共定位；比較發(fā)現(xiàn)，有6個(gè)位點(diǎn)在GWAS和連鎖分析共定位；結(jié)合種子萌發(fā)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選獲得7個(gè)關(guān)鍵候選基因Os06g0108600、Os06g0110200、Os06g0253100、Os06g0282000、Os07g0583600、Os07g0592600和Os09g0432300[27]。Zhao等通過對(duì)178個(gè)水稻品種的根長進(jìn)行表型鑒定，利用GWAS在3、6、7、11號(hào)染色體上檢測(cè)得到qRL3、qRL6、qRL7和qRL11等4個(gè)位點(diǎn)，其中有2個(gè)位點(diǎn)與前人報(bào)道的根系活力相關(guān)QTLs共定位；通過轉(zhuǎn)錄組分析、單倍型分析及基因表達(dá)分析進(jìn)一步對(duì)其中一個(gè)主效位點(diǎn)qRL11進(jìn)行候選基因篩選，確定1個(gè)編碼吲哚乙酸糖基轉(zhuǎn)移酶的基因(OsIAGLU)為該位點(diǎn)的關(guān)鍵候選基因；基因功能分析研究發(fā)現(xiàn)，OsIAGLU通過調(diào)控生長素、茉莉酸、脫落酸和細(xì)胞分裂素等多種激素水平來控制水稻根系生長[28]。Li等通過對(duì)174個(gè)水稻品種3 d的發(fā)芽率進(jìn)行鑒定，利用GWAS在3、8、11號(hào)染色體上檢測(cè)到qGR3.1、qGR3.2、qGR8和qGR11等4個(gè)位點(diǎn)，這些位點(diǎn)均與前人報(bào)道的種子活力相關(guān)QTLs共定位；通過轉(zhuǎn)錄組分析和單倍型分析進(jìn)一步對(duì)其中一個(gè)主效位點(diǎn)qGR11進(jìn)行候選基因篩選，確定1個(gè)編碼2-酮戊二酸/蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(OsOMT)為該位點(diǎn)的關(guān)鍵候選基因；基因功能分析研究發(fā)現(xiàn)，OsOMT通過調(diào)控氨基酸水平、糖酵解代謝和三羧酸(TCA)循環(huán)來控制水稻種子活力[29]。Menard等通過檢測(cè)684個(gè)水稻品種在室內(nèi)環(huán)境下 5 d 的芽長、根長、根表面積、中胚軸長和胚芽鞘長和在田間環(huán)境下不同播種深度(4、8、10 cm)下30 d的中胚軸長、幼苗出苗率、地上部干質(zhì)量、根干質(zhì)量和側(cè)根數(shù)等活力相關(guān)性狀，利用GWAS檢測(cè)到超過 1 000 個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNPs；比較發(fā)現(xiàn)，在7號(hào)染色體的短臂上存在1個(gè)主效位點(diǎn)，該位點(diǎn)在中胚軸長、出苗率和地上部干質(zhì)量等3個(gè)性狀中共定位[30]。Yuan等通過對(duì)貯藏不同時(shí)間的252個(gè)水稻品種的發(fā)芽率進(jìn)行鑒定，利用GWAS在1號(hào)和9號(hào)染色體上檢測(cè)到3個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合粳稻日本晴和秈稻9311構(gòu)建的染色體片段置換系對(duì)位于1號(hào)染色體上的位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，確定該位點(diǎn)的候選基因?yàn)镺sGH3-2，該基因編碼1個(gè)吲哚乙酸氨基化合成酶；基因功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因通過調(diào)控脫落酸通路和胚胎晚期富集蛋白來控制水稻種子老化[31]。Yang等在2年環(huán)境下通過對(duì)263個(gè)水稻品種萌發(fā)3、5、7 d 的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)進(jìn)行表型分析，利用GWAS定位到19個(gè)種子萌發(fā)相關(guān)QTLs，其中有14個(gè)QTLs與前人報(bào)道的種子活力相關(guān)QTLs共定位，有11個(gè)QTLs位于選擇消除區(qū)域；利用種子萌發(fā)期轉(zhuǎn)錄組和功能SNPs位點(diǎn)分析進(jìn)一步對(duì)其中一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的位點(diǎn)qSG11.1進(jìn)行候選基因篩選，確定1個(gè)編碼丙酮酸激酶基因OsPK5為該位點(diǎn)的關(guān)鍵候選基因；基因功能分析研究發(fā)現(xiàn)，OsPK5通過參與調(diào)節(jié)赤霉素、脫落酸及糖酵解代謝等通路來控制水稻種子萌發(fā)[32]。Peng等通過對(duì)202個(gè)水稻品種的成苗率進(jìn)行鑒定，利用GWAS檢測(cè)1個(gè)位于3號(hào)染色體的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)qSP3，該位點(diǎn)的峰值SNP位于一個(gè)編碼含Cupin結(jié)構(gòu)域蛋白基因OsCDP3.10的編碼區(qū)內(nèi)；基因功能研究發(fā)現(xiàn)，該基因通過影響甲硫氨酸、谷氨酸、組氨酸和酪氨酸等氨基酸水平及過氧化氫含量來調(diào)控種子活力[33]。Sun等鑒定了510個(gè)水稻品種的中胚軸長度，利用GWAS在5號(hào)染色體上檢測(cè)到1個(gè)與中胚軸長度顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，并在峰值SNP附近發(fā)現(xiàn)1個(gè)參與油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路的基因OsGSK3，該基因編碼1個(gè)類 GSK3/SHAGGY 蛋白激酶；基因自然變異分析發(fā)現(xiàn)，OsGSK3基因編碼區(qū)的錯(cuò)義SNP與OsGSK3激酶活性存在關(guān)聯(lián)；分子試驗(yàn)證明了油菜素內(nèi)酯通過抑制OsGSK3對(duì)細(xì)胞周期蛋白CYC U2的磷酸化來促進(jìn)水稻中胚軸的伸長，而獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)通路相關(guān)基因SLs/D3通過降解磷酸化的CYC U2來抑制中胚軸的伸長[34]。

3.2 種子萌發(fā)期和成苗期逆境抗性相關(guān)性狀GWAS

Wang等通過對(duì)137個(gè)水稻品種的低溫發(fā)芽力進(jìn)行鑒定，利用GWAS分別在10號(hào)和11號(hào)染色體上獲得48、55個(gè)低溫發(fā)芽候選基因；進(jìn)一步通過基因注釋、序列比較分析和單倍型分析證實(shí)了2個(gè)關(guān)鍵候選基因(Os10g0371100和Os11g0104240)可能與低溫發(fā)芽力相關(guān)聯(lián)[35]。Wang等通過對(duì)187個(gè)水稻品種的低溫發(fā)芽力進(jìn)行鑒定，利用GWAS共檢測(cè)到53個(gè)低溫發(fā)芽相關(guān)QTLs，其中有20個(gè)QTLs 與前人報(bào)道的位點(diǎn)共定位；進(jìn)一步對(duì)一個(gè)編碼A20/AN1型鋅指蛋白(脅迫相關(guān)蛋白)的候選基因OsSAP16進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在低溫環(huán)境下該基因功能的缺失降低了水稻種子的萌發(fā)，而過量表達(dá)則增強(qiáng)了種子的萌發(fā)；基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，極端材料中OsSAP16的表達(dá)水平在低溫條件下存在顯著差異[36]。Yang等對(duì)375個(gè)水稻品種的低溫發(fā)芽力進(jìn)行鑒定，利用GWAS共檢測(cè)到11個(gè)低溫發(fā)芽相關(guān)QTLs；與前人報(bào)道的QTLs比較發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)新的基因(QTLsqLTG_sRDP2-3/qLTG_JAP-3、qLTG_AUS-3和qLTG_sRDP2-12)在該研究中首次報(bào)道；位于10號(hào)染色體的QTLqLTG_sRDP2-10a貢獻(xiàn)率最高，并利用單片段代換系驗(yàn)證了該QTLs的真實(shí)性；進(jìn)一步通過基因表達(dá)分析和序列比對(duì)分析，預(yù)測(cè)了LOC_Os10g22520和LOC_Os10g22484可能為低溫發(fā)芽主效QTLqLTG_sRDP2-10a的關(guān)鍵候選基因[37]。Yang等對(duì)200個(gè)秈稻品種的低溫發(fā)芽力進(jìn)行鑒定，利用GWAS共檢測(cè)到159個(gè)與低溫發(fā)芽顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，分布在水稻12條染色體上；比較發(fā)現(xiàn)，有23個(gè)位點(diǎn)在不同環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)，并預(yù)測(cè)到了569個(gè)與低溫發(fā)芽相關(guān)的候選基因，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選獲得179個(gè)關(guān)鍵候選基因；進(jìn)一步利用20個(gè)極端材料對(duì)其中一個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的序列分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)差異表達(dá)基因Os07g0585500、Os07g0585700和Os07g0585900的自然變異和低溫發(fā)芽表型相關(guān)聯(lián)[38]。Wang等對(duì)339個(gè)水稻品種芽期耐冷性狀進(jìn)行鑒定，利用GWAS檢測(cè)到4個(gè)與芽期耐冷相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分布在水稻1、2、3號(hào)染色體上，其中qCTB-1-1與調(diào)控耐冷性狀miRNAOsa-miR319b共定位，而其他3個(gè)位點(diǎn)為新位點(diǎn)；進(jìn)一步在qCTB-1-2位點(diǎn)篩選得到1個(gè)候選基因OsRab11C1，該基因編碼1個(gè)Rab蛋白；轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與野生型比較，突變OsRab11C1基因可以顯著提高水稻芽期耐冷性，而過表達(dá)OsRab11C1則顯著降低了芽期耐冷性；基因功能分析發(fā)現(xiàn)，OsRab11C1可能通過抑制脫落酸信號(hào)通路和脯氨酸合成來調(diào)控水稻芽期耐冷性[39]。Su等在無氧環(huán)境下對(duì)209個(gè)水稻品種的胚芽鞘長度和胚芽鞘直徑進(jìn)行鑒定，利用GWAS檢測(cè)到26個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)，其中5個(gè)位點(diǎn)與前人報(bào)道的位點(diǎn)共定位；進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選獲得4個(gè)關(guān)鍵候選基因，分別是Os01g0911700(OsVP1)、Os05g0560900(OsGA2ox8)、Os05g0562200(OsDi19-1)和Os06g0548200[40]。Shi等在鹽脅迫下對(duì)478個(gè)水稻品種的萌發(fā)期脅迫敏感指數(shù)進(jìn)行鑒定，利用GWAS檢測(cè)到包含22個(gè)顯著SNPs的11個(gè)位點(diǎn)，其中位于1、5、6、11、12號(hào)染色體上的7個(gè)位點(diǎn)與前人報(bào)道的脅迫相關(guān)位點(diǎn)或基因共定位，例如高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNAR2.1和OsNRT2.2；單倍型分析鑒定到了OsNRT2.2稀有優(yōu)異單倍型，且發(fā)現(xiàn)了該基因在水稻亞群存在分化[41]。Castano-Duque 等在旱季和雨季環(huán)境下分別對(duì) 1 500、2 700個(gè)水稻品種在無氧條件下的發(fā)芽率進(jìn)行鑒定，利用GWAS鑒定到1個(gè)候選基因CLASSY1(OsCLSY1)，該基因參與了RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑；在淹水條件下，突變體clsy1的苗高顯著高于野生型，表明在水稻發(fā)芽和幼苗建成階段，RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑在響應(yīng)淹水脅迫中至關(guān)重要[42]。

基于GWAS鑒定的水稻種子活力相關(guān)基因詳見表1。

表1 基于GWAS鑒定的水稻種子活力相關(guān)基因

4 研究展望

盡管現(xiàn)階段利用GWAS解析水稻種子活力相關(guān)性狀的自然變異取得了一定的進(jìn)展，但還存在一定的局限性。第一，種子活力性狀受環(huán)境影響較大，很多研究并未在多年多個(gè)環(huán)境下進(jìn)行種子活力檢測(cè)；第二，GWAS研究中獲得的位點(diǎn)可能出現(xiàn)假陽性，并未用其他技術(shù)手段對(duì)獲得的位點(diǎn)進(jìn)行輔助驗(yàn)證，比如可構(gòu)建雙親群體進(jìn)行連鎖分析，結(jié)合GWAS鑒定關(guān)鍵位點(diǎn)；第三，遺傳驗(yàn)證缺少證據(jù)，GWAS研究中對(duì)候選基因進(jìn)行驗(yàn)證往往構(gòu)建基因突變體株系、基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系和基因干擾轉(zhuǎn)基因株系等，而未對(duì)差異單倍型進(jìn)行遺傳回補(bǔ)驗(yàn)證。

高活力的種子具有更高的生產(chǎn)潛力及生長優(yōu)勢(shì)，對(duì)保障糧食高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義。因此，科研人員需要在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展高活力水稻種質(zhì)資源收集與鑒定、高活力優(yōu)異等位變異挖掘與育種利用、種子活力相關(guān)基因定位及種子活力相關(guān)基因不同等位變異的功能解析，以期為未來培育高活力水稻新品種提供重要基礎(chǔ)。