基于高內(nèi)涵篩選技術(shù)的吳茱萸次堿肝毒性研究

郭 麗，路青瑜，李 嬌，楊付梅，孫黔云

(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014)

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodiaruteacarpa(Juss.) Benth var.Officinalis (Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodiaruteacarpa(Juss.) Benth.var.bodinier (Dode) Huang的干燥近成熟的果實(shí)。其性味辛熱、苦，有小毒，歸肝、胃、脾、腎經(jīng)，能散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉，用于頭痛、腹痛、腳氣、腹瀉等，為溫中止痛的上品[1]。《本草綱目》中有提及吳茱萸的毒性：“有小毒，動(dòng)脾火，病目者忌之”[2]。

作為貴州大宗藥材吳茱萸，吳茱萸次堿(ruteacarpine，RUT)是其主要成分，藥理學(xué)研究表明，RUT具有抗高血壓、抗癌、抗炎癥反應(yīng)、抗抑郁、保護(hù)胃黏膜等多種藥理作用[3]。近年來隨著吳茱萸及其制劑在臨床上的使用率越來越高，因服用吳茱萸不當(dāng)產(chǎn)生的毒性時(shí)有發(fā)生，曾出現(xiàn)1例報(bào)道因服用吳茱萸過量致死，在死者的血液中檢測(cè)到吳茱萸生物堿[4]。有文獻(xiàn)研究顯示[5]，吳茱萸的水提、醇提、揮發(fā)油3個(gè)組分都表現(xiàn)出了一定的肝毒性。RUT是吳茱萸的主要成分之一，有文獻(xiàn)報(bào)道稱其在高濃度下能使肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中的AST、ALP和LDH水平升高，表現(xiàn)出明顯的肝毒性[6]，但其具體的肝毒性機(jī)制尚不清晰。課題組的前期篩選結(jié)果也表明，RUT對(duì)HepG2有明顯的毒性。本研究基于高內(nèi)涵篩選技術(shù)開展了RUT對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用及機(jī)制研究，以期為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)RUT的毒性機(jī)制和臨床安全用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑胎牛血清來源于南美；RUT(PS000914)購于成都普思生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(8121371)購自美國Gibco公司；熒光染料Hoechst 33342(C1022)、Mitotracker Red CMXRos(C1049B)、DAPI(C1002)、活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033S-1)、NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒(SN368)、鈣離子熒光探針Fluo-4 AM(S1060)購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；DIR細(xì)胞膜染料(DD0408)購于江蘇宇恒生物科技有限公司；p38(8690s)、ERK 1/2(4695s)、p-ERK 1/2(4370s)、JNK(9252s)、p-JNK(9255s)、c-Fos(2250s)、c-Jun(9165s)、p-NF-κB p65(3033s)單克隆抗體(一抗)、Alexa Flour 488熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG、Alexa Flour 488熒光標(biāo)記山羊抗鼠IgG抗體(二抗)購于美國CST公司；Alexa Flour 488熒光標(biāo)記p-p38(sc-166182)、p-STAT3(sc-8059)和Alexa Flour 647熒光標(biāo)記STAT3(sc-8019)抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；Annexin V-FITC試劑盒(556547)購于上海優(yōu)寧維公司；阿霉素(D8740-25 mg)購于北京索萊寶生物科技有限公司；二甲基亞砜，美國Sigma公司。

1.2 儀器高內(nèi)涵篩選儀型號(hào)為CellInsight Cx5(美國賽默飛公司)；TS2-S-SM倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；NovoCyte 2040R流式細(xì)胞儀(美國ACEA公司)；連續(xù)波長酶標(biāo)儀Gen5(美國基因公司)；賽默飛CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；Milli-Q Integral 超純水系統(tǒng)(美國Milipore公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組HepG2細(xì)胞來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，生長于胎牛血清濃度為10%的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在含有5% CO2，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中。待HepG2細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，用0.25%的不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化下來，離心后用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×108個(gè)·L-1，每孔100 μL細(xì)胞接種于Ⅱ型膠原包被的96孔板中，使得每孔的細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)[7]。RUT終濃度為5、10、25、50、100 μmol·L-1，阿霉素為陽性對(duì)照，終濃度為1.25、0.625 μmol·L-1，對(duì)照組為0.1% DMSO，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

1.4 MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞的活力將處于對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL(1.0×104個(gè)/孔)。置37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給藥處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入20 μL MTT后于37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，然后再加入50 μL的三聯(lián)液充分溶解沉淀，過夜孵育后，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測(cè)其OD值。HepG2細(xì)胞的生長抑制率/%=[(實(shí)驗(yàn)組OD570 nm-對(duì)照組OD570 nm)/對(duì)照組OD570 nm]×100%。

1.5 細(xì)胞ROS水平檢測(cè)給藥處理6、12、24、48 h后，分別向每孔中加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃ DCFH-DA染料，使得各染料的終濃度分別為5、10 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育30 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養(yǎng)基溶液。使用高內(nèi)涵篩選儀采集圖像，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測(cè)DCFH-DA染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.6 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)給藥處理3、6、12、24、48 h后，向每孔中加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃ Mito-Tracker Red CMXRos染料，使得各染料的終濃度分別為5、0.2 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養(yǎng)基溶液。使用高內(nèi)涵篩選儀采集圖像，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于551 nm/576 nm檢測(cè)CMXRos染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè)給藥處理3、6、12、24、48 h后，向每孔中加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃的Hoechst 33342染料，然后再加入50 μL已預(yù)熱至37 ℃ Flou-4 AM染料，使得各染料的終濃度分別為5、10 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養(yǎng)基溶液。使用高內(nèi)涵篩選儀采集圖像，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測(cè)Flou-4 AM染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 細(xì)胞膜完整性檢測(cè)給藥處理3、6、12、24、48 h后，用預(yù)熱至37 ℃的完全培養(yǎng)基配制含有細(xì)胞核染料Hoechst 33342和DIR混合的活細(xì)胞染料，使得各染料的終濃度分別為5、500 μmol·L-1。染料加入后于37 ℃避光孵育40 min，棄上清液，每孔用200 μL PBS洗3次，最后加入50 μL完全培養(yǎng)基溶液。使用高內(nèi)涵篩選儀采集圖像，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于742 nm/767 nm檢測(cè)DIR染色，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

每年軍坡節(jié)，祭祀活動(dòng)體現(xiàn)出情感的歷史積淀與文化傳承,潛在地影響著社會(huì)中每個(gè)人的行為方式，節(jié)日中的歷史認(rèn)同是重要的歷史教育及愛國教育的德育資源。

1.9 MAPK、NF-κB、JAKs-STATs 信號(hào)通路活化水平檢測(cè)細(xì)胞給藥處理3、24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入固定液固定15 min，洗滌液洗細(xì)胞3次，加入免疫熒光染色封閉液，室溫振蕩封閉1 h，吸棄封閉液，分別加入相應(yīng)的抗體，p38(1 ∶200)、ERK 1/2(1 ∶800)、p-ERK 1/2(1 ∶400)、JNK(1 ∶200)、NF-κB p65(1 ∶400)、p-NF-κB p65(1 ∶400)、c-Jun(1 ∶200)、c-Fos(1 ∶3 200)和p-JNK(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜；吸棄一抗，洗滌液洗3次，加入相應(yīng)的二抗Alexa Flour 488山羊抗兔IgG(1 ∶500)與Alexa Flour 488山羊抗鼠IgG(1 ∶500)，室溫避光孵育1 h，DAPI染色20 min，洗滌3次，最后加入50 μL PBS，采用高內(nèi)涵分析儀進(jìn)行檢測(cè)，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測(cè)Alexa Flour 488，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。直標(biāo)抗體p-p38(1 ∶50)、STAT3(1 ∶50)、p-STAT3(1 ∶50)直接室溫避光孵育3 h后，加入DAPI染色20 min，洗滌3次，最后加入50 μL PBS。使用高內(nèi)涵篩選儀采集圖像，每組雙復(fù)孔，每孔采集12個(gè)視野，第一通道于388 nm/461 nm檢測(cè)Hoechst 33342染色，第二通道于488 nm/525 nm檢測(cè)p-p38、p-STAT3，STAT3的通道波長設(shè)置為650 nm/647 nm，Thermo ScientificTMHCS StudioTM分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。

1.10 細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)將HepG2細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2、100%濕度中培養(yǎng)，給藥處理48 h后，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基吸棄，用PBS洗滌1遍，胰酶消化7 min后加入培養(yǎng)基震蕩5 min，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔V形板中，離心使細(xì)胞沉淀，吸棄上清，加入結(jié)合緩沖液將細(xì)胞洗滌一遍，離心吸凈緩沖液，加入20 μL(含1 ∶50的抗FITC Annexin V抗體和1 ∶20 PI)結(jié)合緩沖液，于37 ℃震蕩孵育30 min，加入200 μL結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，離心吸棄上清，然后加入200 μL結(jié)合緩沖液重懸后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用軟件SPASS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 RUT對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響RUT暴露于HepG2細(xì)胞，分別作用24、48 h后，與對(duì)照組相比，25、50、100 μmol·L-1均能使HepG2細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，且具有劑量依賴性，而陽性藥物阿霉素組在所設(shè)濃度下細(xì)胞活力均有下降，差異具有顯著性(P<0.01)(Fig 1)。

2.2 RUT對(duì)HepG2細(xì)胞數(shù)目、核面積和DNA量的影響RUT分別作用于HepG2細(xì)胞24、48 h后，與對(duì)照組相比，100 μmol·L-1的RUT使HepG2細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，5、10、25、50 μmol·L-1的RUT對(duì)HepG2細(xì)胞數(shù)目無明顯影響，RUT對(duì)DNA量和核面積無明顯變化(Fig 2)。

Fig 1 Effect of RUT on cell viability of HepG2 by MTT n=3)A：The cells were cultured with RUT for 24 h.B：The cells were cultured with RUT for 48 h.*P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 2 Effect of RUT on HepG2 cell number (A),DNA density (B),nuclear area (C) n=3)Nuc:nuclear **P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 vs control.

2.3 RUT對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響100 μmol·L-1的RUT暴露于細(xì)胞6 h后就出現(xiàn)ROS水平顯著升高(P<0.01，F(xiàn)ig 3A)；24、48 h時(shí)，ROS的含量變化程度隨濃度的增大依次增加，表明RUT能快速誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS水平的上升，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷(P<0.01，F(xiàn)ig 3C,D)。

2.4 RUT對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位、鈣離子內(nèi)流和細(xì)胞膜完整性的影響RUT作用于HepG2細(xì)胞6 h后，與對(duì)照組相比，RUT 50、100 μmol·L-1使HepG2細(xì)胞鈣離子明顯升高(P<0.01，P<0.05，F(xiàn)ig 4A)，而相同濃度的RUT在6 h時(shí)間點(diǎn)會(huì)使得HepG2細(xì)胞細(xì)胞膜完整性被破壞(P<0.01，P<0.05，F(xiàn)ig 4B)，50、100 μmol·L-1RUT 組線粒體膜電位水平明顯降低(P<0.01，F(xiàn)ig 4C)。

Fig 3 Effect of RUT on ROS of HepG2 cells by high-content analysis n=3)A：The cells were cultured with RUT for 6 h with different concentrations.B：The cells were cultured with RUT for 12 h with different concentrations.C：The cells were cultured with RUT for 24 h with different concentrations.D：The cells were cultured with RUT for 48 h with different concentrations.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

Fig 4 Effect of RUT on calcium ion internal flow,cell membrane integrity and mitochondrial film potential of HepG2 by high-content analysis n=3)A and B：The cells were cultured with RUT for 6 h with different concentrations.C：The cells were cultured with RUT for 48 h with different concentrations.*P<0.05，**P<0.01 vs control.

2.5 RUT對(duì)MAPK信號(hào)通路活化的影響RUT作用HepG2細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，100 μmol·L-1RUT組和1.25 μmol·L-1ADR組p-ERK1/2、p-JNK、p-STAT3和p-p38的蛋白熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01，P<0.05，F(xiàn)ig 6)，50 μmol·L-1RUT組的p-ERK1/2、p-JNK、p-STAT3和p-p38表達(dá)有上調(diào)(P<0.01，P<0.05，F(xiàn)ig 8)，而不同濃度RUT組總蛋白未見明顯變化。

2.6 RUT對(duì)AP-1信號(hào)通路的影響50、100 μmol·L-1RUT作用HepG2細(xì)胞3 h后，與對(duì)照組相比，AP-1相關(guān)蛋白c-Jun、c-Fos表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，25 μmol·L-1RUT組c-Fos表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，其余濃度下c-Jun、c-Fos蛋白的表達(dá)未見明顯上調(diào)(Fig 9，10)。

2.7 RUT對(duì)NF-κB信號(hào)通路活化的影響HepG2細(xì)胞暴露于100 μmol·L-1RUT作用3 h后，磷酸化NF-κB p65水平明顯升高(P<0.01，F(xiàn)ig 11C)，細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度(nuc/cyt fluorescence intensity)比值與對(duì)照組相比未見明顯差異(Fig 11B)。

2.8 RUT對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響不同濃度的RUT處理HepG2細(xì)胞48 h，隨著濃度的增加，發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞比例逐漸增加，100 μmol·L-1RUT組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01，F(xiàn)ig 12)，在10、25、50 μmol·L-13個(gè)濃度下均引起細(xì)胞凋亡(P<0.05，F(xiàn)ig 12)。

Fig 5 Effect of RUT on levels of p-Erk/Erk (A) and p-JNK/JNK (B) of HepG2 cells by high-content screening assay(×200)

Fig 6 Effect of RUT on levels of p-Erk/Erk (A) and p-JNK/JNK (B) of HepG2 cells for 24 h by high-content screening *P<0.05，**P<0.01 vs control.

Fig 7 Effect of RUT on levels of p-STAT3/STAT3 (A) and p-p38/p38 (B) of HepG2 cells by high-content screening assay(×200)

Fig 8 Effect of RUT on levels of p-STAT3/STAT3 (A) and p-p38/p38 (B) of HepG2 cells for 24 h by high-content screening n=3)*P<0.05，**P<0.01;##P<0.01 vs control.

Fig 9 Effect of RUT on levels of c-Jun and c-Fos of HepG2 by high-content screening assay(×200)

Fig 10 Effect of RUT on levels of c-Jun and c-Fos of HepG2 for 3h by high-content screening n=3)**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01 vs control.

3 討論

在臨床用藥歷程中，中藥肝毒性損傷(drug-induced liver injury，DILI)和腎毒性一樣，是一種臨床上常見的藥物不良反應(yīng)，它的毒性在藥物性靶器官毒性中排第二位，僅僅次于心臟毒性[8]。肝臟作為藥物解毒的一個(gè)重要靶器官，承受著藥物產(chǎn)生的毒性，隨著中藥在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及近年來中藥毒理學(xué)研究的不斷深入，使用中藥導(dǎo)致的肝損傷問題報(bào)道越來越多，這一點(diǎn)引起了人們的高度重視，中藥導(dǎo)致肝損傷問題已經(jīng)成為了在中藥使用過程中不得不注意的問題。藥物的肝毒性研究在藥物發(fā)現(xiàn)早期評(píng)價(jià)階段起著至關(guān)重要的作用，而高內(nèi)涵篩選技術(shù)是近年來在藥物活性篩選和早期安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用的研究技術(shù)，通過利用熒光顯微鏡成像自動(dòng)化和圖片集成分析，可以達(dá)到藥物早期毒性監(jiān)測(cè)與監(jiān)控，這也是新藥研發(fā)必不可少的一部分[9]。我們?cè)谇捌诤Y選中發(fā)現(xiàn)RUT對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的毒性，考慮到吳茱萸藥材和含有吳茱萸的制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及近年來吳茱萸安全性事件的報(bào)道時(shí)有發(fā)生，因此，本研究采用高內(nèi)涵技術(shù)，開展了RUT對(duì)HepG2細(xì)胞毒性的作用和機(jī)制研究，以期為吳茱萸及吳茱萸制劑的臨床應(yīng)用和安全性提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

本研究發(fā)現(xiàn)[10]，RUT暴露于HepG2細(xì)胞后，其細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞膜完整性被破壞，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，呈現(xiàn)初步的毒性反應(yīng)。研究結(jié)果顯示，由細(xì)胞內(nèi)的氧化自由基、過氧化氫和其下游的氧化物等產(chǎn)生的ROS，調(diào)控著許多生理和病理過程，是常見的細(xì)胞凋亡通路影響因素。進(jìn)一步對(duì)Ca2+內(nèi)流、線粒體膜電位和ROS的追蹤，顯示Ca2+發(fā)生了明顯的內(nèi)流，線粒體膜電位紊亂，其ROS水平顯著上調(diào)，炎癥相關(guān)蛋白出現(xiàn)磷酸化，這表明在一定條件下，RUT對(duì)HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性，而其機(jī)制可能與RUT引起的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有關(guān)。有研究顯示通過抑制ROS引起的線粒體氧化應(yīng)激，可使得細(xì)胞凋亡率明顯下降[11]，當(dāng)細(xì)胞在受到有毒的物質(zhì)刺激時(shí)，其內(nèi)的ROS含量會(huì)突然升高，從而誘發(fā)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激，使得相關(guān)通路開放，凋亡因子被激活，細(xì)胞DNA被損壞，最終引起細(xì)胞凋亡[12]。線粒體膜電位作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要指標(biāo)，在特定信號(hào)的刺激下會(huì)發(fā)生紊亂，線粒體通透性改變，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的一些與凋亡相關(guān)的因子會(huì)影響到線粒體的正常功能[13-14]。

Fig 11 Effect of RUT on levels of translocation of NF-κB p65 and p-NF-κB p65 of HepG2 for 3 h by high-content screening n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control.

本研究發(fā)現(xiàn)，MAPK、NF-κB和JAKs-STATs信號(hào)通路被激活，它們是細(xì)胞內(nèi)炎癥密切相關(guān)的3條信號(hào)通路，并且它們之間有著復(fù)雜的交互作用。絲裂原活化激酶信號(hào)通路MAPK是涉及多種炎癥反應(yīng)的一條重要的信號(hào)通路，它在細(xì)胞內(nèi)壓力、紫外線和生長因子等的刺激下被激活而發(fā)揮相應(yīng)的作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的過度增殖、生長分化、細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞的自噬過程來調(diào)控細(xì)胞的生長，MAPK主要由JNK、p38和ERK這3條信號(hào)通路構(gòu)成[15]。MAPK信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB和AP-1的活化并加重炎癥反應(yīng)，AP-1被激活后，組成AP-1的兩個(gè)亞基c-Jun和c-Fos蛋白表達(dá)量會(huì)明顯增多，并會(huì)轉(zhuǎn)化成有活性的磷酸化形式，在靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)上發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄作用[16]。NF-κB是體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，通常以p50和p65組成異源二聚體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，NF-κB p65活化后能夠使得多種黏附分子、炎癥細(xì)胞因子、趨化因子的活化，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥相關(guān)反應(yīng)以及細(xì)胞生長等方面起重要作用[17]。STAT3是JAKs-STATs信號(hào)通路的一個(gè)重要組成部分，可以通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)的蛋白來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞各種各樣的活動(dòng)中扮演著重要的作用[18]。在本研究中，100 μmol·L-1RUT可明顯增加ERK1/2、JNK和p38的磷酸化水平，AP-1相關(guān)蛋白c-Jun和c-Fos的表達(dá)均有明顯上升，提示RUT可能通過激活MAPK信號(hào)通路，使得AP-1的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)，從而引發(fā)后續(xù)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞暴露于100 μmol·L-1RUT后，磷酸化NF-κB p65水平明顯上升，但是其核轉(zhuǎn)位強(qiáng)度不明顯，其原因可能與檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)和p-NF-κB p65的入核過程被抑制有關(guān)。在本研究中，100 μmol·L-1RUT可增強(qiáng)STAT3的磷酸化水平，表明JAKs-STATs信號(hào)通路被激活。這3個(gè)信號(hào)通路在引起RUT對(duì)HepG2細(xì)胞損傷中的相互調(diào)控關(guān)系仍需進(jìn)一步的深入研究。

Fig 12 Effects of different concentrations of RUT for 48 h on early n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs control.

本研究結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞暴露于RUT后，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高、鈣內(nèi)流強(qiáng)度增強(qiáng)，線粒體膜電位紊亂、而其細(xì)胞膜完整性被打破，造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，引發(fā)炎癥MAPK、NF-κB和JAKs-STATs信號(hào)通路的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的損傷和凋亡。

(本論文研究是在貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥理與生物活性研究中心孫黔云課題組完成。)