CD13分子對非小細胞肺癌浸潤Treg細胞免疫抑制的機制研究

王心曉,程小珍

(1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 海口市人民醫(yī)院 呼吸內科,海南 ?？?570208;2.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 海口市人民醫(yī)院 腫瘤科,海南 ?？?570208)

CD13分子對非小細胞肺癌浸潤Treg細胞免疫抑制的機制研究

王心曉1,程小珍2

(1.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院 呼吸內科,海南 ?？?570208;2.中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院 ?？谑腥嗣襻t(yī)院 腫瘤科,海南 ?？?570208)

目的 通過檢測非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC)組和正常對照組中CD13分子與CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的表達，研究CD13分子對NSCLC浸潤Treg細胞免疫抑制的機制。方法 隨機選取2013年6月～2014年5月間中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院收治的NSCLC患者160例為NSCLC組，選取同期因其他肺部疾病行手術切除的患者60例作為正常對照組。采用反轉錄RT-PCR和免疫組化檢測2組CD13分子與CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的表達，并進行比較。結果 對照組中CD13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA的表達均顯著低于NSCLC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；CD13分子在NSCLC組的表達明顯多于對照組:對照組中有12例（20.0%)CD13呈陽性表達，NSCLC組患者中有131例呈陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)；NSCLC組的CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞表達水平（24.1±6.3)顯著高于對照組（0.7±2.1)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。結論 CD13分子可降低組織相容性復合物Ⅱ（MHCⅡ)的粘附抗原決定簇，從而降低T細胞對腫瘤細胞表面抗原的識別能力，導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫耐受。這可能是CD13分子對非小細胞肺癌浸潤Treg細胞免疫抑制的主要分子機制。

CD 13分子；非小細胞肺癌；Treg細胞；免疫抑制

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的腫瘤之一,其發(fā)病率已經(jīng)位居腫瘤性疾病的首位,而且還有逐年升高的趨勢,肺癌已經(jīng)成為當今癌癥首要致死原因。其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%,明確診斷時已有70%左右發(fā)展成為晚期或轉移性肺癌［1-2］。大量證據(jù)顯示肺癌的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)密切相關［3-4］。調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)是一類具有免疫調節(jié)功能的T細胞亞群,研究表明只有CD4+CD25+FoxP3+T細胞具有免疫調節(jié)功能［5-6］。CD4+CD25+FoxP3+T細胞的免疫無應答和免疫抑制使得腫瘤免疫逃逸,從而抑制機體對腫瘤細胞的免疫清除［7-8］。研究發(fā)現(xiàn),非小細胞肺癌患者外周血中的Treg細胞明顯升高,而且Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中的Treg細胞水平明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者［9-10］。因此,調節(jié)T細胞介導的免疫抑制成為腫瘤免疫治療的主要障礙。CD 13分子是一種細胞膜糖蛋白,又名氨基膚酶N(aminopeptidase N,APN)。研究發(fā)現(xiàn)CD 13分子蛋白在腫瘤細胞的表面大量表達,可以降解細胞外基質蛋白,從而參與腫瘤細胞的侵襲、轉移和生長［11-12］。此外,CD 13分子能夠降解白細胞介素(IL-8),從而降低機體免疫功能;降低組織相容性復合物Ⅱ(major histocompatibility complexⅡ,MHCⅡ)的粘附抗原決定簇,從而降低T細胞對腫瘤細胞表面抗原的識別能力,導致機體對腫瘤的免疫無應答或免疫耐受［13-14］。為了進一步研究CD 13分子對非小細胞肺癌浸潤Treg細胞免疫抑制的機制,本課題(研究)隨機選取2013年6月～2014年5月間本院收治的NSCLC患者160例和正常對照組60例作為研究對象,對2組CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的表達進行分析比較?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 隨機選取2013年6月～2014年5月間本院收治的NSCLC患者160例和正常對照組60例作為研究對象。其中男性130例,女性90例;年齡35～80歲,平均年齡(59.87±9.23)歲,年齡選取無顯著差異。NSCLC患者納入標準:①外科手術切除后冰凍和常規(guī)處理證實病理類型為鱗癌和腺癌;②臨床無其他惡性腫瘤的證據(jù);③近1個月未經(jīng)放化療治療;④近3個月未使用過免疫增強劑。

1.2 材料 CD13:上游5'-TCCGGAATTCATGGCCAAGGGCTTCTATATTTC-3';下游5'-CCGGATTTAAATC-TATTTGCTGTTTTCTGTGAACCACTG-3'。 CD4+CD25+FoxP3+Treg:上游 5'-GCTGGTGCTGGAGAAGGAGAAG-3';下游5'-GTGGAGGAACTCTGGGAATGTG-3'。β-actin(內參基因)引物序列:上游 5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3';下游5'-ATGTCACGCCACGATTTCC-CGC-3'。以上引物均由上海生工生物技術服務有限公司合成。均用焦炭酸二乙醇溶解,最終濃度為1 pmol/μL。

Trizol RNA提取試劑盒,美國Invitrogen公司公司),M-MuLV反轉錄酶(美國NEB公司),5 U/uL Taq DNA聚合酶(廣州東盛生物科技有限公司);CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞MACS分離試劑盒(德國美天妮公司)。

CD 13兔抗人單克隆抗體(美國Epitomics公司);兔抗人Foxp3單克隆抗體(美國Santa Cruz公司);二抗為羊抗兔免疫球蛋白(美國DAKO公司);SP免疫組化試劑盒(上海信然生物技術有限公司);DAB顯色劑(北京中杉金橋公司)

1.3 方法

1.3.1 取材:標本取材后用PBS緩沖液淋洗3次,于離體20 min之內取新鮮的組織60 mg,立即凍存于-72℃冰箱。異位子宮內膜組織經(jīng)HE染色后在光鏡下確定異位的腺上皮和間質細胞。待檢測標本于2 h之內提取總RNA,逆轉錄生成cDNA,置于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆?。其余的標本均?%的多聚甲醛進行固定,并經(jīng)乙醇脫水和石蠟包埋,再用切片機連續(xù)切片［15］。

1.3.2 RT-PCR擴增CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg:具體實驗操作按照RT-PCR試劑盒的說明進行,反應體系為50 uL,94℃下先預變性4min,然后按照94℃,30 s;60℃,60 s;72℃,120 s,反復進行30個循環(huán),最后在72℃下延伸10min。取RT-PCR的產物10 uL,置于2%的瓊脂糖凝膠中電泳,相對分子質量標準采用puc Mix Marker,使用凝膠掃描系統(tǒng)對目的基因和β-actin基因進行光密度掃描,目的基因光密度與β-actin基因光密度的比值反映該目的基因mRNA的相對表達水平。

1.3.3 免疫組化檢測CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg:采用免疫化學SP法進行。選擇視野清晰的高倍鏡視野進行觀察,然后按照著色程度和著色的百分比來評分。得分標準:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性細胞所占百分比:＜5%為0分,5%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分。結果分為4級:1～3分為陰性(-),4～5分為弱陽性(+),6～7分為中陽性(++),8分以上為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計和分析。正態(tài)計量資料以“±s”表示,組間比較用t檢驗;等級資料組間比較采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對照組和NSCLC組中CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+Treg的mRNA表達 使用 RT-PCR法檢測 CD 13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA在對照組和SCLC組中的表達情況。檢測結果顯示,對照組中CD 13和CD4+CD25+FoxP3+Treg mRNA的表達均顯著低于NSCLC組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,見表 1、圖 1)。

表1 2組CD 13分子和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA表達比較Tab.1 Comparison of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA expression beween two groups

圖1 2組CD 13和CD4+CD25+FoxP3+TregmRNA的表達*P＜0.05,與NSCLC比較Fig.1 Them RNA expression of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+Treg in two groups*P＜0.05,compared with NSCLC group

2.2 CD 13分子蛋白在對照組和NSCLC組中的表達CD13分子蛋白在非小細胞肺癌中表達多,在正常對照組中表達較少,見圖2。由表2可知,60例對照組中CD 13蛋白陽性表達率僅為20.0(12/60),同期160例非小細胞肺癌中有131例(81.9%)CD 13蛋白呈陽性表達,明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 CD 13分子在對照組和NSCLC組中的表達(SP,×400)Fig.2 The expression of CD 13 in NSCLC and control groups(SP,×400)

表2 CD 13分子在對照組和NSCLC組中的表達Tab.2 The expression of CD 13 in NSCLC and control groups

2.3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對照組和NSCLC組中的表達 鏡下可見CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞形態(tài)完整,結構清晰,散在分布于腫瘤組織中,尤其在正常組織與癌組織的交界處密集分布。由圖3和表3可知,NSCLC組織中 CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞的表達水平(24.1±6.3)顯著高于正常對照組(0.7±2.1),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對照組和NSCLC組中的表達(SP,×400)Fig.3 The expression of CD4+CD25+FoxP3+Treg in NSCLC and control groups(SP,×400)

表3 CD4+CD25+FoxP3+Treg在對照組和NSCLC組中的表達Tab.3 The expression of CD4+CD25+FoxP3+Treg in NSCLC and control groups

3 結論

人CD13基因位于染色體的15q25-26,其基因編碼序列包含有20個外顯子,表達受近端和遠端兩個啟動子的調節(jié)。CD13蛋白是一種膚鏈端水解酶,由967個氨基酸組成,分子量150 kD左右。一般表達于腫瘤干細胞膜的表面,當腫瘤細胞自我復制增殖時,CD13分子會遷移到細胞與細胞的接觸部位,通過水解基底膜的基膜和基底膜蛋白來激活信號轉換通路,從而參與腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移［16-17］。目前,在許多實體腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了CD13的高表達。推測其在腫瘤細胞中主要起一下幾種作用［18-19］:①增強腫瘤細胞的侵襲性,有利于腫瘤的轉移;②促進腫瘤血管的生成,有研究發(fā)現(xiàn),當外界供養(yǎng)不足時,血管生成因子VEGF可誘導CD13的表達,促進新血管的生成;③通過降解IL-8、MHCⅡ型粘附抗原決定簇降低T細胞對抗原的識別能力,從而加速腫瘤細胞的增值和轉移,導致腫瘤細胞的免疫逃逸。研究表明,CD13抑制劑可降低腫瘤細胞的侵襲力,破壞毛細血管網(wǎng)的形成,延長NSCLC患者的生存期。

調節(jié)性T細胞是一類具有免疫調節(jié)功能的特殊T細胞亞群。研究表明非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平顯著高于健康人,進一步的研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平高于Ⅰ期和Ⅱ期患者,隨著化療病情好轉后CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平也有所下降。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原能夠活化Treg細胞,從而抑制機體腫瘤產生免疫應答,導致腫瘤逃逸。因此,Treg細胞介導的免疫抑制成為腫瘤免疫逃逸的重要機制。

本研究組采用RT-PCR和免疫組化法檢測非小細胞肺癌患者和正常對照組中CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達。研究結果顯示,NSCLC患者CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達均明顯高于正常對照組,提示非小細胞肺癌患者免疫功能失調與機體CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的表達水平可能相關。這也提示是否能通過抑制體內CD13和CD4+CD25+FoxP3+Treg的水平治療非小細胞肺癌,以提高患者的生存率。

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(編校:吳茜)

Study on themechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of non-small cell lung cancer patients

WANG Xin-xiao1,CHEN Xiao-zhen2

(1.Department of Respiratory Medicine,Haikou City People's Hospital,Central South University Xiangya Medical College Hospital,Haikou 570208,China;2.Department of Oncdogy,Medicine,Haikou City People's Hospital,Central South University Xiangya Medical College Hospital,Haikou 570208,China)

Objective To detect the expression of CD 13 molecule and CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC and control groups,in order to investigate themechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of NSCLC patients.Methods 160 cases of NSCLC patients from June 2013 to May 2014 in our hospitalwere selected,and another 60 caseswithout NSCLCwere selected as control group.The expression of CD 13 molecule and CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC and control groupswere detected by RT-PCR and immunehistochemistry.Results ThemRNA expression of CD 13 and CD4+CD25+FoxP3+in control group were significantly lower than that in the NSCLC group(P＜0.05).The expression of CD 13 protein in NSCLC group was significantly higher than that in control group.The positive expression rate of the control group were only 20.0%(12/60),and increased to 81.9%(131/160)in NSCLC group,the differencewas statistically significant(P＜0.05).The expression level of CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in NSCLC(24.1±6.3)was significantly higher than that in the control group(0.7±2.1,P＜0.05).Conclusion The CD13 molecule can reduce MHCⅡepitope,thereby reducing the recognition ability of T cells to tumor cell,leading to no response or immune tolerance of tumor cell.This the possiblemainmechanism of CD 13 molecule on Treg cell immune suppression of non-small cell lung cancer patients.

CD 13 molecuar;non-small cell lung cancer;regulatory T cells;immune suppression

R734

A

1005-1678（2014)06-0011-04

海南省衛(wèi)生廳科研課題(瓊衛(wèi)2010-70)

王心曉，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：呼吸臨床及基礎，E-mail：hnhx123456@sohu.com。