基因芯片法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因快速診斷中的應用價值

楊映暉 伍定輝 蘇偉明 董春萍 姚向陽

隨著對結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制研究的深入，多種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的檢測方法相繼出現(xiàn)。基因芯片法是近年來在醫(yī)療領域最具影響力的科技發(fā)展成果之一，可快速檢測臨床疑似標本中的分枝桿菌屬DNA。本研究采用前瞻性的方法，通過對患者同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及其比例法藥物敏感性試驗(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗”)3種方法進行結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因rpoB、katG及inhA的檢測，并對3種檢驗結(jié)果進行對比分析，探討基因芯片檢測技術(shù)的優(yōu)勢和不足。

資料和方法

一、資料收集

采用前瞻性的方法，收集2017年6月至2018年6月廈門大學附屬第一醫(yī)院肺科門診及住院的疑似肺結(jié)核患者的痰標本。標本采用患者晨痰，同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert法和MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗3種方法進行檢測。肺結(jié)核診斷標準參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[1]。本研究收集933例患者的晨痰標本；其中，男674例，女259例；年齡11～84歲，中位年齡56歲。

二、儀器與試劑

分枝桿菌菌種鑒定芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產(chǎn)品貨號301030)；結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司；產(chǎn)品貨號301035)；Extractor 36核酸快速提取儀(博奧生物集團有限公司)；LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀及配套儀器(博奧生物集團有限公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測儀(美國Cepheid 公司)；結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒(Cepheid AB 瑞典賽沛公司；產(chǎn)品貨號1000061494)；BACTEC MGIT 960全自動培養(yǎng)儀(美國BD公司)；分枝桿菌藥物敏感性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

三、菌種及耐藥基因檢測

(一)基因芯片法檢測

1.標本制備及核酸提?。禾禈吮炯尤氲攘?0% NaOH溶液，振蕩液化15～20 min，以3035×g離心5 min，離心后棄上清。再加入1 ml生理鹽水，充分振蕩后以12 830×g離心5 min，離心后棄上清。向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入上述標本后，使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃水浴5 min，再以8910×g離心1 min。

2.PCR擴增：采用不對稱擴增法對相關(guān)基因位點進行擴增。分別采用PCR擴增試劑1、2、3對每份樣品進行3管PCR擴增反應。分別向3管中加入2 μl模板DNA和18 μl PCR擴增試劑。每管PCR反應體系總體積為20 μl，置于PCR擴增儀中進行擴增。PCR反應條件為：37 ℃激活10 min；94 ℃變性600 s；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個循環(huán)；72 ℃ 420 s。

3.芯片雜交與結(jié)果判讀：擴增反應完成后，在利福平芯片雜交管中加入3 μl擴增產(chǎn)物1、3 μl擴增產(chǎn)物2和9 μl雜交緩沖液，在異煙肼芯片雜交管加入3 μl擴增產(chǎn)物1、3 μl擴增產(chǎn)物3和9 μl雜交緩沖液。15 μl雜交反應混合物于95 ℃變性5 min，后立即冰水浴3 min。吸出13.5 μl雜交反應混合物加入芯片陣列，再置于50 ℃雜交儀中雜交120 min。雜交后經(jīng)洗滌甩干后使用LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯軟件進行信號的讀取及結(jié)果的判讀。

(二)MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗

取4倍體積的4% NaOH溶液溶于痰標本中，旋渦振蕩混勻，使痰標本充分液化，靜置15 min，以3035×g離心5 min，棄上清后中和，用一次性無菌吸管吸取處理后的痰標本0.5 ml，接種于液體培養(yǎng)管中，加載到BACTEC MGIT 960全自動培養(yǎng)儀上。培養(yǎng)陽性后，通過萋尼抗酸染色確定是否培養(yǎng)出抗酸桿菌；取陽性菌株接種于羅氏培養(yǎng)基進行傳代，并接種噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸鑒別培養(yǎng)基，鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。比例法藥敏試驗：挑取對數(shù)生長期的結(jié)核分枝桿菌菌落，用滅菌生理鹽水配制1麥氏濁度的菌懸液，然后使用無菌的10 μl標準接種環(huán)，進行100倍和10 000倍稀釋，用10 μl無菌標準接種環(huán)分別挑取10 000倍稀釋菌懸液一環(huán)，劃線接種于一組空白對照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，再用10 μl無菌標準接種環(huán)分別挑取100倍稀釋菌懸液一環(huán)，劃線接種于另外一組空白對照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基，擰緊培養(yǎng)基管蓋，豎直置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察記錄藥敏試驗結(jié)果。

(三)GeneXpert檢測

將痰標本與消化液以1∶2的比例加入15 ml無菌干燥離心管中，振蕩，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。使用與GeneXpert MTB/RIF樣品盒配套的一次性移液管，將2 ml處理后的樣品加至樣品盒中，將樣品盒掃描二維碼，錄入信息，放入GeneXpert MTB/RIF儀器中，2 h后讀取記錄檢測結(jié)果。

四、質(zhì)量控制

所有參加本研究的工作人員均接受嚴格、系統(tǒng)的培訓并掌握實施方案，嚴格按照標準納入患者，完成各項操作，進行結(jié)果判斷。實驗過程均做陰性、陽性質(zhì)量控制。

五、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以“率(%)”描述，采用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值≥0.75為兩者一致性較好，0.4≤Kappa值<0.75為兩者一致性一般，Kappa值<0.4為兩者一致性較差。各百分率的95%CI采用OpenEpi 3.01軟件進行計算。

結(jié) 果

一、基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的效能

933例患者的痰標本中，基因芯片法檢測出陽性484例，GeneXpert檢測出陽性462例，MGIT 960培養(yǎng)出陽性411例。3種檢測方法均為陽性的標本有395例，從3種檢測結(jié)果均為陽性的標本中通過Excel表以完全隨機的方式抽取232份分別進行異煙肼耐藥基因katG及inhA檢測。以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準，基因芯片法檢測出異煙肼耐藥的敏感度為86.67%(26/30)，特異度為96.53%(195/202)，一致性達95.26%(221/232)，Kappa值為0.798(0.682～0.914)，具有良好的一致性(表1)。

二、基因芯片法和GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的效能

分別采用基因芯片法和GeneXpert進行利福平耐藥基因rpoB檢測，同樣以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準，基因芯片法檢測出的利福平耐藥敏感度為93.75%(30/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達96.55%(224/232)，Kappa值為0.862(0.768～0.956)，兩者具有良好的一致性(表2)。

以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準，GeneXpert檢測出的利福平耐藥敏感度為84.38%(27/32)，特異度為97.00%(194/200)，一致性達95.26%(221/232)，Kappa值為0.803(0.691～0.915)，兩者具有良好的一致性(表2)。

表1 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法檢測異煙肼耐藥性的效能

表2 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能

表3 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥一致性的比較

將基因芯片法與GeneXpert進行比較，結(jié)果顯示兩種方法檢測出的利福平耐藥陽性一致性為90.91%(30/33)，陰性一致性為96.98%(193/199)，總一致性達96.12%(223/232)，Kappa值為0.847(0.749～0.945)，具有良好的一致性(表3)。

討 論

耐藥結(jié)核病是重大的公共衛(wèi)生問題，為控制結(jié)核病的一大障礙[2]。盡早掌握結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況及影響因素，可提高耐藥結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)和治療能力[3]，對減少耐多藥結(jié)核病的傳播具有重大意義[4]。因此，臨床實驗室迫切需要開發(fā)特異度和敏感度高、檢測速度快的檢測方法。

目前，最普遍使用并被視為診斷結(jié)核病參考標準的MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗，存在操作繁瑣、陽性率低、耗費時間長和生物安全性差等問題，明顯滯后于結(jié)核病早期診斷的期望[5]，無法滿足臨床快速診斷的需求。近幾年，隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展，分子診斷技術(shù)成為結(jié)核病快速診斷的主要手段[6]。其中基因芯片技術(shù)敏感、準確且簡便可靠，可以同時檢測到多種靶基因，如異煙肼耐藥基因katG和inhA基因啟動子及利福平耐藥基因rpoB等常見突變位點。該檢測手段所需樣本量少、準確、信噪比極小且易于操作，開辟了新的臨床診斷視野。

本研究將基因芯片法與GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗進行了深入比較，在結(jié)核分枝桿菌快速檢測及結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測方面具有良好的敏感度和特異度。基因芯片法結(jié)果與傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)和藥敏試驗結(jié)果具有良好的一致性，并且彌補了后者耗時長、陽性率低、占用實驗室空間的缺陷；與GeneXpert方法比較，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，但GeneXpert只能檢測一種耐藥基因(rpoB)，基因芯片技術(shù)能一次檢測katG、inhA和rpoB3種耐藥基因，對耐多藥結(jié)核病的快速診療更有應用價值。代小偉等[7]、許榕青等[8]和王小路等[9]的研究結(jié)果也均顯示基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因檢測中具有明顯優(yōu)勢，與本研究所獲得的結(jié)果基本一致。

但是，每種方法都有各自的局限性，與其設計原理、操作復雜性及結(jié)果判讀偏倚等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因芯片法和GeneXpert在結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性例數(shù)方面，與MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗方法存在部分差異。分析可能的原因是：結(jié)核分枝桿菌的檢出結(jié)果受多種因素限制，如細菌代謝及繁殖是否旺盛，是否處于休眠狀態(tài)，是否存在形態(tài)多樣性等因素[10]。結(jié)核分枝桿菌處于休眠或者衰亡狀態(tài)，就可能出現(xiàn)培養(yǎng)陰性的情況。同時也突顯出當今分子診斷技術(shù)普遍存在的不足之處，即不能判斷結(jié)核分枝桿菌是否是具備傳染性的活菌，不能準確評價所用藥品的療效。所以基因芯片法不能完全取代MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗方法，兩者可以互相補充。

綜上所述，基因芯片法在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因的檢測中，具有較高的敏感度和特異度，且檢測時間短，與傳統(tǒng)方法相比，具有快速、安全、準確、有效的特點，有利于耐多藥結(jié)核病的早期診斷及防控，值得在臨床診療中推廣應用。