動(dòng)物膠中氨基酸種類的測(cè)定與分析

劉存芳， 龐海霞， 王 偉， 張 強(qiáng)， 田光輝

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 漢中 723000)

動(dòng)物膠中氨基酸種類的測(cè)定與分析

劉存芳， 龐海霞， 王 偉， 張 強(qiáng)， 田光輝

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 漢中 723000)

采用微波法和常壓回流兩種方法對(duì)動(dòng)物膠在酸催化下進(jìn)行水解，將水解物分別用異硫氰酸苯酯和三甲基氯硅烷衍生，運(yùn)用反相液相色譜技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分析測(cè)定該衍生物，以此來探討動(dòng)物膠中所含氨基酸的種類和相對(duì)含量。經(jīng)測(cè)試分析，動(dòng)物膠中含有14種氨基酸，基本上是以亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸為主，該研究可對(duì)動(dòng)物膠中的組成分析及其利用提供技術(shù)支撐。

動(dòng)物膠； 氨基酸； 測(cè)定； 色譜分析法

動(dòng)物膠(Animal glue)是一種動(dòng)物黏合劑(Animal adhesive)，主要用動(dòng)物之皮、骨、腱、角芯及鱗等含膠原蛋白的組織而制成的，是我國(guó)傳統(tǒng)的黏合劑之一，應(yīng)用廣泛，歷史悠久。動(dòng)物膠的制備大都是以動(dòng)物的皮、骨或筋等為原料，加入芒硝和燒堿，經(jīng)加熱煎煮，將原料中所含膠原水解、提取和干燥后制成的蛋白質(zhì)固形物，其主要用作黏接劑、乳化劑和選礦絮凝劑，造紙以及紡織工業(yè)中施膠劑等，在食品、醫(yī)藥品、保健品和化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域也有著廣泛的用途。早在3000多年前的周朝，已經(jīng)使用動(dòng)物膠作為木船的嵌縫密封膠，《考工記》中記載有動(dòng)物膠的制備方法。在我國(guó)已出土的多種古代陶質(zhì)彩繪文物中，顏料黏結(jié)使用了多種黏合劑，由于文物年代的久遠(yuǎn)和地域的差異[1-2]，加之采樣以及樣品處理的復(fù)雜性[3]，對(duì)于古代彩繪陶質(zhì)等文物顏料黏合劑的研究，一直是古代彩繪文物研究領(lǐng)域的重要課題[4-7]。CRUZ-CAńIZARES de la C J等人[8]對(duì)西班牙18世紀(jì)貴族大廈里墻上的壁畫中的黏合劑用氣相色譜(GC)技術(shù)進(jìn)行了分析，闡明了該壁畫彩繪使用的黏合劑是動(dòng)物膠；Ilaria Bonaduce等人[9]對(duì)中國(guó)秦始皇兵馬俑的Kneeling archer中的黏合劑進(jìn)行了分析，初步確定出該陶俑的彩繪使用的黏合劑可能是蛋清。確定動(dòng)物膠中氨基酸的種類和含量這對(duì)闡明黏合劑是至關(guān)重要的[10]。本文對(duì)動(dòng)物膠分別在酸性介質(zhì)中用微波和常壓回流兩種方法進(jìn)行水解，微波水解物用異硫氰酸苯酯衍生，采用高效液相色譜(HPLC)分析；常壓回流水解物用三甲基氯硅烷衍生，用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)分析，來確定動(dòng)物膠中氨基酸種類及其相對(duì)含量，這對(duì)動(dòng)物膠中的組成分析和開發(fā)利用可提供一些幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

氨基酸單組分標(biāo)準(zhǔn)樣品和氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液均購(gòu)于美國(guó)Waters公司，進(jìn)口分裝(色譜純)；動(dòng)物膠(市售，陜西省渭南市臨渭區(qū))以豬皮和牛皮熬制而成，粉碎過200目篩，密封保存?zhèn)溆?；異硫氰酸苯酯、乙酸乙酯、硫酸鈉、鹽酸(AR，西安市化學(xué)試劑廠)；碳酸鈉、三甲基氯硅烷、氯仿(AR，成都市科龍化工試劑廠)；水為二次蒸餾水。

高效液相色譜儀(2996型二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)，氨基酸專用分析柱Kromasil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦公司)；Finnigan-Trace DSQ型GC/MS儀(美國(guó)熱電公司)，DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；WX-3000微波消解儀(上海屹堯公司)；BSA224S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；RE2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上?？粕齼x器有限公司)。

1.2 分析方法

1.2.1 高效液相色譜工作條件

流動(dòng)相A：乙酸鈉和乙腈的混合液，pH為6.4；流動(dòng)相B：60%乙腈水溶液。A和B流動(dòng)相采用曲線型梯度淋洗法，檢測(cè)波長(zhǎng)為255 nm，柱溫為38 ℃。

1.2.2 GC-MS工作條件

氣相色譜條件：載氣為He氣，柱溫：80～260 ℃；初始溫度為60 ℃，2 min后，以6 ℃/min程序升溫至180 ℃，保持4 min。再以5 ℃/min程序升溫至280 ℃，并保持5 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，衡流模式流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為0.5 μL，分流比為50∶1，色質(zhì)界面溫度為250 ℃。質(zhì)譜條件：EI離子源，電離能量70eV，離子源溫度250 ℃，倍增器電壓978V，掃描范圍50～550質(zhì)量單位。掃描模式：全掃描。定性方法：各色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖通過計(jì)算機(jī)譜庫(kù)檢索來確定；定量方法：各組分相對(duì)含量通過總離子流圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)用峰面積歸一化法。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HPLC分析樣品的處理

準(zhǔn)確稱取動(dòng)物膠粉末0.500mg于全聚四氟乙烯罐中，加入6mol/L的鹽酸4mL，控溫60 ℃下進(jìn)行微波水解6min，過濾，濾液用水定容至25mL的容量瓶中備用。移取20μL溶液進(jìn)行真空干燥，干燥后加入新蒸餾的0.1mL異硫氰酸苯酯進(jìn)行衍生，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80 ℃的水浴回流30min，然后加水2mL，用乙酸乙酯萃取三次，無水硫酸鈉干燥過夜，蒸餾回收乙酸乙酯，再真空干燥衍生物備用。進(jìn)樣前樣品加入流動(dòng)相3mL進(jìn)行稀釋，用高效液相色譜分析樣品中氨基酸的種類及其相對(duì)含量[11]。氨基酸單組分標(biāo)準(zhǔn)樣品和氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液按同樣方法處理、測(cè)定，作為定性和定量進(jìn)行對(duì)照。

1.3.2GC-MS分析樣品的處理

準(zhǔn)確稱取動(dòng)物膠粉末1.000mg于燒瓶中，加入6mol/L的鹽酸10mL，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，90 ℃水浴中回流水解5h，用碳酸鈉中和，調(diào)節(jié)pH為7.2～7.8，減壓濃縮至干，真空干燥后用三甲基氯硅烷1mL進(jìn)行衍生化反應(yīng)，用氯仿溶解稀釋5倍后，吸取0.5μL，用GC-MS測(cè)試氨基酸的種類及其含量[2,6,12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 動(dòng)物膠水解條件的選擇

結(jié)合文獻(xiàn)[4-5]，實(shí)驗(yàn)中考察了水解酸度、水解液用量、水解時(shí)間、溫度等對(duì)于動(dòng)物膠水解的影響，優(yōu)化動(dòng)物膠水解條件。水解時(shí)分別以2、4、6、8、10mol/L的鹽酸作為樣品的水解液進(jìn)行水解酸度研究，6mol/L鹽酸為最佳水解液。液相色譜分析采用微波水解，微波功率為300W，溫度為60 ℃，6mol/L鹽酸4mL，水解6min。GC-MS分析的樣品加入6mol/L鹽酸4mL，分別在70、80、90、100 ℃氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流水解，回流水解時(shí)間分別在3、4、5、6、7h下選擇，實(shí)驗(yàn)選擇水解條件為90 ℃下回流5h。

2.2 液相色譜的分析

液相色譜法分析氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品和動(dòng)物膠的水解樣品，其結(jié)果分別如圖1和圖2所示。在實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品和動(dòng)物膠水解樣品中的14種氨基酸都能夠很好地被分離。從圖1和圖2可以看出，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖清晰地顯示出14種氨基酸，分離效果良好，依次分別是天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和苯丙氨酸。

1.天冬氨酸(asp)，2.谷氨酸(glu)，3.絲氨酸(ser)，6.甘氨酸(gly)，7.纈氨酸(val)，8.蛋氨酸(met)，9.丙氨酸(ala)，10.脯氨酸(pro)，12.羥脯氨酸(hyp)，13.酪氨酸(tyr)，16.異亮氨酸(ile)，18.亮氨酸(leu)，20.賴氨酸(lys)，21.苯丙氨酸(phe)

1.天冬氨酸(asp)，2.谷氨酸(glu)，3.絲氨酸(ser)，6.甘氨酸(gly)，7.纈氨酸(val)，8.蛋氨酸(met)，9.丙氨酸(ala)，10.脯氨酸(pro)，12.羥脯氨酸(hyp)，13.酪氨酸(tyr)，16.異亮氨酸(ile)，18.亮氨酸(leu)，20.賴氨酸(lys)，21.苯丙氨酸(phe)

圖2動(dòng)物膠的水解物樣品經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的色譜圖中呈現(xiàn)出了22個(gè)峰。結(jié)合圖1和圖2可確定出動(dòng)物膠樣品中含有的14種氨基酸的種類，并采用峰面積歸一化法確定各氨基酸的相對(duì)百分含量結(jié)果如表1，其相對(duì)含量較高的氨基酸分別是絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸。

表1 動(dòng)物膠樣品中14種氨基酸的相對(duì)含量

2.3 GC-MS的分析

用GC-MS對(duì)動(dòng)物膠水解樣經(jīng)三甲基氯硅烷衍生后進(jìn)行氨基酸檢測(cè)，圖3和表2分別為動(dòng)物膠的水解樣品經(jīng)三甲基氯硅烷衍生后的GC-MS總離子流圖和相對(duì)百分含量。在動(dòng)物膠的水解樣品中相對(duì)含量較高的氨基酸分別是亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、纈氨酸，其次是異亮氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、羥脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸，含量較低的分別是脯氨酸、賴氨酸、酪氨酸。其他氨基酸，如色氨酸(trp)、蘇氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、精氨酸(ary)和組氨酸(his)未被檢出。

圖3 動(dòng)物膠的水解物用三甲基氯硅烷衍生后的GC-MS總離子流圖

表2 GC-MS分析動(dòng)物膠樣品中氨基酸的相對(duì)含量

賴氨酸、脯氨酸和甘氨酸是動(dòng)物蛋白質(zhì)的特征氨基酸，在動(dòng)物膠中甘氨酸的相對(duì)含量較高，賴氨酸和脯氨酸的相對(duì)含量均較低。人體必需的8種氨基酸中，除色氨酸和蘇氨酸未檢出外，其他6種氨基酸如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸均被檢出，且相對(duì)含量均較高。部分氨基酸未被檢出是由于在動(dòng)物膠制備時(shí)堿性介質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間煎熬造成損失和破壞，或是由于測(cè)定樣品時(shí)前處理酸性水解過程中損失和破壞所致。圖3表明測(cè)定中鑒定出了壬二酸(Azelaic Acid)、棕櫚酸(palmitic acid)和硬脂酸(Stearic acid)，且其含量相當(dāng)可觀，它們可能是來源于動(dòng)物膠在制備過程中殘留的脂肪水解物。在色譜圖3中還顯示出幾個(gè)未知峰信號(hào)，其結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步確定。

根據(jù)表1和表2表明HPLC和GC-MS檢測(cè)動(dòng)物膠樣品中氨基酸相對(duì)百分含量，用不同的水解方法、不同衍生試劑衍生和不同的分析方法檢測(cè)，動(dòng)物膠樣品中的氨基酸主要組分基本保持一致，其相對(duì)含量存在一些差異。HPLC法檢測(cè)動(dòng)物膠樣品中氨基酸含量較高的組分為絲氨酸、亮氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸，而GC-MS測(cè)定動(dòng)物膠樣品中氨基酸含量較高的組分為亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、纈氨酸。實(shí)驗(yàn)分別用了微波和常壓回流酸性水解法對(duì)動(dòng)物膠進(jìn)行水解，水解方法亦影響動(dòng)物膠樣品的水解程度和衍生化的程度，從而影響測(cè)定結(jié)果。用HPLC法檢測(cè)動(dòng)物膠樣品中氨基酸，耗費(fèi)樣品量較大，GC-MS法檢測(cè)耗費(fèi)樣品量小，適合少量或微量樣品中氨基酸種類的分析和測(cè)定。

3 結(jié) 論

(1)可用HPLC法和GC-MS法對(duì)動(dòng)物膠中氨基酸的種類及其含量進(jìn)行檢測(cè)，后者耗費(fèi)樣品量少，檢測(cè)快速，適合微量樣品中氨基酸種類的檢測(cè)分析。

(2)采用不同的水解方法和不同的分析儀器方法進(jìn)行測(cè)定，動(dòng)物膠樣品中的氨基酸主要組分基本保持一致，但其相對(duì)含量存在差異，水解條件的優(yōu)化選擇，是影響動(dòng)物膠中氨基酸的種類及其含量的重要因素之一。

(3)從動(dòng)物膠中確定出了14種氨基酸，動(dòng)物膠中的氨基酸主要是以亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸為主，這對(duì)確定一些古代彩繪陶俑顏料使用黏合劑的分析有幫助作用[13]，同時(shí)，可以為將動(dòng)物膠開發(fā)成為功能性保健食品提供一些參考。

[1] SCIUTTO G,DLICI L S,GUARDIGLI M,et al.Single and multiplexed immunoassays for the chemiluminescent imaging detection of animal glues in historical paint cross-sections[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2013,405(2):933-940.

[2] GAUTIER G,COLOMBINI M P.GC-MS identification of proteins in wall paintings:a fast clean-up procedure to remove salt interferences[J].Talanta,2007,73(1):95-102.

[3] ZHENG Qin,WU Xiao-feng,ZHENG Hai-ling,et al.Development of an enzyme-linked-immunosorbent-assay technique for accurate identification of poorly preserved silks unearthed in ancient tombs[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2015,407(13):3861-3867.

[4] 李實(shí).敦煌壁畫中膠結(jié)材料的定量分析[J].敦煌研究,1995(3):29-46.

[5] 蘇伯民,張愛民,胡之德,等.色譜法在古代繪畫膠結(jié)材料分析中的應(yīng)用[J].敦煌研究,2000(1):82-85.

[6] COLOMBINI M P,FUOCO R,GIACOMELLI A,et al.Characterization of proteinaceous binders in wall painting samples by microwave-assisted acid hydrolysis and GC-MS determination of amino acids[J].Studies in conservation,1998,43(1):33-41.

[7] CASTRO R M,CARBO M T D,MARTINEZ V P,et al.Study of binding media in works of art by gas chromatographic analysis of amino acids and fatty acids derivatized with ethyl chloroformate[J].Journal of Chromatography A,1997,778(1):373-381.

[8] CRUZ-CAńIZARES de la C J,DOMéNECH-CARBó M T,GIMENO-ADELANTADO J V,et al.Suppression of pigment interference in the gas chromatographic analysis of proteinaceous binding media in paintings with EDTA[J].Journal of Chromatography A,2004,1025(2):277-285.

[9] BONADUCE I,BLAENSDORF C,DIETEMANN P,et al.The binding media of the polychromy of Qin Shihuang’s Terracotta Army[J].Journal of Cultural Heritage,2008,9(1):103-108.

[10] YAN Hong-tao,AN Jing-jing,ZHOU Tie,et al.Identification of proteinaceous binding media for the polychrome terracotta army of Emperor Qin Shihuang by MALDI-TOF-MS[J].Science Bulletin,2014,59(21):2574-2581.

[11] 田光輝,劉存芳,王曉.反相高效液相色譜法測(cè)定香茶菜籽中游離的亞麻酸含量[J].陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,23(3):87-90.

[12] BONADUCE I,RIBECHINI E,MODUGNO F,et al.Analytical Approaches Based on Gas Chromatography Mass Spectrometry (GC/MS) to Study Organic Materials in Artworks and Archaeological Objects[J].Topics in Current Chemistry,2016,374(1):1-37.

[13] GHEZZI L,DUCE C,BERNAZZANI L,et al.Interactions between inorganic pigments and rabbit skin glue in reference paint reconstructions[J].Journal of Thermal Analysis and Calorimetry,2015,122(1):1-8.

[責(zé)任編輯：張存鳳]

Analysis and determining of amino acids from animal glue

LIU Cun-fang, PANG Hai-xia, WANG Wei, ZHANG Qiang, TIAN Guang-hui

(Shaanxi Key Laboratory of Catalysis, School of Chemical & Environmental Sciences,Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China)

Chinese traditional animal glue was hydrolyzed by two ways with microwaves hydrolyzed and in ordinary press by acidic circumfluence, the analysis kinds of amino acids by high performace liquid chromatography with microwaves hydrolyzed has been analyzed after the hydrolyte was derived with benzoyl isothiocyanate, and the hydrolyte derived with trimethylchlorosilane was determined by gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that 14 kinds of amino acids were determined in the animal glue, the major components were leucine, glycin and phenylalanine, this research will provide scientific proof and technique support for the identify and characterization of animal glue.

animal glue; amino acid; determining; chromatography

2016-07-09

2016-10-17

陜西省科技廳社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF270)；陜西省教育廳服務(wù)地方專項(xiàng)項(xiàng)目(15JF013)

劉存芳(1971—)，女，陜西省合陽(yáng)縣人，陜西理工大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的開發(fā)利用。

1673-2944(2017)02-0069-05

R917; R282.7

A