肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義

戴彭辰，何成詩(shī)，劉一誠(chéng)，王超群，李慧英

（1成都中醫(yī)藥大學(xué)，2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義

戴彭辰1，何成詩(shī)2，劉一誠(chéng)1，王超群1，李慧英1

（1成都中醫(yī)藥大學(xué)，2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都610075）

目的：探究肺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的表達(dá)及意義.方法：選取62例肺癌組織作為觀察組，10例正常組織作為對(duì)照組，采用免疫組化方法檢測(cè)各組織中E2F-1的表達(dá)情況.結(jié)果：E2F-1在觀察組中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.74％，高于對(duì)照組的10.00％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且E2F-1的表達(dá)隨著腫瘤分期的升高而增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.結(jié)論：肺癌組織中E2F-1的高表達(dá)可作為腫瘤浸潤(rùn)程度的標(biāo)記物，對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展起著重要作用.

E2F-1；肺癌；免疫組織化學(xué)

0 引言

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，是目前發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人民群眾健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其中男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位［1］.肺癌的病因至今尚不完全明確，轉(zhuǎn)錄因子E2F-1是由人類E2F-1基因編碼出的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員.E2F家族在控制細(xì)胞周期及抑癌基因功能上起到重要作用，也是小DNA致癌病毒轉(zhuǎn)化蛋白的靶點(diǎn).研究表明，腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的異常調(diào)控有著密切聯(lián)系［2-3］，但目前在肺癌發(fā)病機(jī)制的研究中對(duì)E2F-1的作用了解較少.本研究采用免疫組化法，檢測(cè)肺癌組織及正常組織中E2F-1的表達(dá)，探討其臨床表達(dá)意義，現(xiàn)報(bào)道如下.

1 材料和方法

1.1組織材料 收集保存的62例肺癌組織石蠟包埋標(biāo)本，其中男32例，女30例，年齡27～69（平均55.1±3.4）歲.其中，標(biāo)本顯示腺癌20例、鱗癌28例、未分化癌14例.另選取10例癌旁正常肺組織作為對(duì)照組.兩組材料的一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性.

1.2免疫組化方法 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法：①石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水.②3％H2O2去離子水（無(wú)色液體）孵育10～30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性.③蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min.④候選步驟：采用抗原修復(fù)：微波（建議30 min內(nèi)4次中火）、高壓、酶修復(fù)方法.⑤血清封閉：室溫15～30 min.⑥滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育2～3 h或4℃過(guò)夜.PBS沖洗，3 min×5次.⑦滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育30 min～1 h.⑧PBS沖洗，3 min×5次.⑨滴加SP（鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶），室溫或37℃孵育30 min～1 h.⑩PBS沖洗，3min×5次.〇11 DAB顯色劑顯色.〇12自來(lái)水充分沖洗.〇13可進(jìn)行復(fù)染，脫水、透明.〇14選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒┓馄?E2F-1（1B100，抗原修復(fù)）為鼠抗單克隆抗體，上海勝隆公司產(chǎn)品，PBS替代一抗陰性對(duì)照.

1.3結(jié)果判斷 E2F-1染色后，根據(jù)染色范圍及染色程度進(jìn)行綜合判斷，分為陰性（-）和陽(yáng)性（+）2個(gè)等級(jí).陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)志：細(xì)胞核及胞質(zhì)中呈現(xiàn)黃褐色或黃色顆粒樣變（圖1、圖2）.

圖1　免疫組化SP法染色，細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)

圖2　免疫組化SP法染色，細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用％表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

E2F-1在對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率為10.00％（1/ 10），而在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為67.74％（42/ 62），E2F-1在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組. E2F-1在肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理特征存在密切聯(lián)系.統(tǒng)計(jì)顯示，腫瘤的分期越晚，E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率越高，其中T1期表達(dá)最低，T2期及T3期表達(dá)越高，且不同分期之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；E2F-1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)也出現(xiàn)了比無(wú)轉(zhuǎn)移者的高表達(dá)率，但兩者對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；E2F-1的表達(dá)在病理結(jié)果顯示，其在鱗癌、腺癌、未分化癌中陽(yáng)性表達(dá)率依次增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）.

表1　肺癌E2F-1表達(dá)與病理特征關(guān)系（％）

3 討論

E2F是1986年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期調(diào)控因子，它作為轉(zhuǎn)錄因子在cyclin-cdk-Rb通道中被激活.目前研究［4-6］顯示，E2F家族中的多個(gè)成員蛋白包含許多進(jìn)化保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域包括：DNA結(jié)合域、與受分化調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子蛋白（DP）之間相互作用的二聚化結(jié)構(gòu)域、富含酸性氨基酸的轉(zhuǎn)活化結(jié)構(gòu)域以及位于轉(zhuǎn)活化結(jié)構(gòu)域中的抑癌蛋白關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域.該蛋白與其他兩個(gè)成員E2F-2及E2F-3具有額外的周期蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，E2F-1以細(xì)胞周期依賴性的模式優(yōu)先與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRB結(jié)合，并可以同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞增殖及p53-依賴/非依賴的細(xì)胞凋亡.

E2F異二聚體結(jié)合pRb時(shí)，E2F的轉(zhuǎn)錄激活就會(huì)被抑制.E2F的釋放一般發(fā)生在G1中后期，并影響G1PS期所需的蛋白表達(dá)及DNA合成，pRb去磷酸化同時(shí)被cy-clin EPcdk2和cyclin DPcdk4P6所催化，從而影響細(xì)胞的周期運(yùn)行，因此E2F被認(rèn)為是能夠調(diào)控細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子［7-8］.研究［9］還顯示，E2F的異常高表達(dá)與一些腫瘤的形成和發(fā)展存在密切聯(lián)系，并在一定程度上能夠引起細(xì)胞的過(guò)度增殖和惡性轉(zhuǎn)化.

相關(guān)研究［10］指出，E2F-1是E2F蛋白家族中最先被克隆的轉(zhuǎn)錄因子，其特性也是整個(gè)E2F家族中最先被了解的.研究［11］還指出，E2F-1在腫瘤的發(fā)生中起到了重要作用.在多種癌癥中，均發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)的E2F-1，這表明轉(zhuǎn)錄因子E2F-1在機(jī)體內(nèi)起到促癌基因的效果，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用.Ray等［12］在Rb1（+P-）鼠的實(shí)驗(yàn)研究中指出，去除E2F-1的表達(dá)后，小鼠的甲狀腺腫瘤及垂體腫瘤的發(fā)生率顯著降低.體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)［13］證實(shí)，成纖維細(xì)胞的惡性變與E2F-1的高表達(dá)有關(guān).但也有研究［14］指出，E2F-1作為轉(zhuǎn)錄因子起抑癌作用，出現(xiàn)促癌的原因可能與實(shí)驗(yàn)方法或者組織、細(xì)胞類型不同有關(guān).有研究發(fā)現(xiàn)，E2F-1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移到肺組織中表達(dá)水平明顯高于結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移到肝組織的表達(dá)水平［15］.在惡性支氣管上皮細(xì)胞株的培育中，惡性支氣管上皮細(xì)胞株中E2F-1表達(dá)高于正常細(xì)胞株［16］.而E2F-1是否在原發(fā)性肺癌組織中高表達(dá)的研究報(bào)道卻很少見(jiàn).

本研究結(jié)果顯示，E2F-1在肺癌組織中表達(dá)比正常的肺組織顯著增高，說(shuō)明在細(xì)胞周期中，E2F-1的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖、縮短細(xì)胞周期，對(duì)肺癌的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用.也有專家［17］指出，E2F-1的激活引起下游抑癌基因p73發(fā)生突變，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡障礙，這是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因之一.另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌病理類型的不同也與E2F-1的表達(dá)有關(guān)，鱗癌中E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率為55.00％，腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到了67.86％，而在未分化癌中其陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)80.00％，這說(shuō)明E2F-1在肺癌、腺癌及未分化癌中具有高表達(dá)率，提示可以在以后的基因靶向治療中成為一個(gè)突破口.研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子E2F-1的高表達(dá)還跟腫瘤的生物學(xué)行為存在關(guān)系.謝慶祥等［10］研究指出，E2F-1的表達(dá)高低和膀胱癌的分級(jí)及分期有密切聯(lián)系.研究［18］還發(fā)現(xiàn)，E2F-1的高表達(dá)直接影響乳腺癌的預(yù)后，高表達(dá)的E2F-1基因在頭頸部癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后，腫瘤浸潤(rùn)性顯著增強(qiáng).

本研究還發(fā)現(xiàn)，E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)率隨著腫瘤分期的提高而增高，表明E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分期存在顯著相關(guān)性.研究結(jié)果還顯示，E2F-1的陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定聯(lián)系，但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不顯著，這表明E2F-1在腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中不能作為標(biāo)記物，也有可能與本次實(shí)驗(yàn)的方法及材料有關(guān).

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Expression and significance of transcription factor E2F-1 in lung cancer tissues

DAIPeng-Chen1，HE Cheng-Shi2，LIU Yi-Cheng1，WANG Chao-Qun1，LIHui-Ying11Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，2Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China

AIM：To investigate the expression and significance of transcription factor E2F-1 in the pathogenesis of lung cancer. METHODS：A total of 62 cases of lung cancer were selected as the observation group and 10 cases of normal tissue as the control group.The expression of E2F-1 was detected by immunohistochemicalmethod.RESULTS：The rate of positive expression of E2F-1 in observation group was 67.74％，which was higher than 10.00％in the control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression of E2F-1 increased with tumor staging increasing，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.CONCLUSION：The high expression of E2F-1 can be used as amarker of tumor invasion in lung cancer tissues，which plays an important role in the development of lung cancer.

E2F-1；lung cancer；immunohistochemistry

R734.2

A

2095-6894（2015）12-01-03

2015-10-27；接受日期：2015-11-13

戴彭辰.博士，主治醫(yī)師.研究方向：肺癌.

E-mail：hzdpc1977@163.com

何成詩(shī).碩士，主任醫(yī)師，教授.研究方向：呼吸內(nèi)科.

E-mail：18980880131@126.com