尿KIM-1和NGAL在評估慢性腎臟病腎小管間質(zhì)損傷中的作用*

李晨晨，張蓓茹，何 平，趙自霞，白 瑜，田 密，張永哲

(中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧沈陽 110004)

近年來，腎小管間質(zhì)病變在慢性腎臟病(CKD)進展中的作用越來越得到廣泛的關(guān)注。大量研究表明,腎小管間質(zhì)病變是所有腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的必要途徑，其嚴重程度與CKD進展速度和預后密切相關(guān),影響程度甚至超過了腎小球疾病本身[1-2]。然而腎臟病理活檢雖然具有診斷腎小管間質(zhì)病變程度的能力，可是由于它是一種侵入性穿刺檢查，其臨床應用受到多方面條件限制，故尋找可評估CKD患者腎小管間質(zhì)損傷的早期無創(chuàng)生物標志物將有利于早期診斷，具有重要的臨床意義。近年來在臨床當中已經(jīng)確定了多種反映腎小管間質(zhì)損傷的生物標志物[3]，其中最為關(guān)注的是腎損傷分子-1(KIM-1)和中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)。但是這些研究數(shù)據(jù)大多數(shù)來自于不同病因?qū)е碌募毙阅I損傷模型，而且在不同的疾病狀態(tài)下各個指標的臨床意義具有一定的差異性[4]。在CKD腎小管間質(zhì)損傷中KIM-1和NGAL是否同樣具有預測價值尚不明確。因此，本研究通過測定尿液中KIM-1及NGAL水平，評估它們在CKD患者中對腎小管間質(zhì)損傷的預測價值，尤其是早期預測價值，以指導臨床。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院腎臟內(nèi)科2017年2-9月確定診斷為CKD，且住院期間經(jīng)過腎臟病理活檢存在腎小管間質(zhì)病變的患者103例作為試驗組，除外在腎穿刺之前應用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療藥物，近期有急性腎損傷，或具有重癥感染、心肺功能不全、惡性腫瘤等全身性疾病患者。其中女性患者和男性患者分別為47例、56例，平均年齡(45.15±13.58)歲。根據(jù)腎小管間質(zhì)病變程度將試驗組患者進一步分為輕度損傷組、輕-中度損傷組和重度損傷組。腎臟病理種類包括：乙型病毒肝炎相關(guān)性腎小球腎炎1例，高血壓腎損傷1例，紫癜腎炎2例，抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關(guān)性血管炎3例，局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎4例，局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎4例，糖尿病腎病5例，狼瘡性腎炎5例，系膜增生性腎小球腎炎6例，微小病變腎小球腎炎6例，IgA腎病29例，特發(fā)性膜性腎病41例。所有參與試驗患者均知情同意。同時選取在本院體檢中心體檢的健康體檢者17例作為健康對照組，其中男8例，女9例，平均(39.18±12.76)歲。

1.2方法

1.2.1檢測指標 收集試驗組和健康對照組的一般資料，包括性別、年齡。試驗組在腎穿刺當日早晨完善尿常規(guī)檢查，同時，空腹采血，采用常規(guī)方法檢測各項生化指標，包括血肌酐、血尿素、血尿酸、血胱抑素C、血紅蛋白、血清蛋白、血糖、三酰甘油、膽固醇。留取腎穿刺前1周內(nèi)的3次24 h尿蛋白定量，計算平均值。根據(jù)CKD-EPI公式估算腎小球濾過率(eGFR)[5]。

1.2.2病理資料 所有試驗組患者采取俯臥位，在超聲引導下進行經(jīng)皮腎穿刺活檢，標本常規(guī)采用HE、PASM、PAS及Masson染色，進行光鏡及免疫熒光檢查，同時完善電鏡檢查。腎小管間質(zhì)病變涵蓋急性病變，臨床特征為灶性壞死、上皮細胞萎縮變性等，而慢性病變的臨床特征為炎細胞浸潤等。在對腎小管間質(zhì)病變進行半定量分級時充分結(jié)合Banff病理評分標準[6]：無腎小管間質(zhì)損傷為0分，損傷范圍0%～5%為1分，損傷范圍6%～25%為2分，損傷范圍26%～50%為3分，損傷范圍>50%為4分，分為輕度損傷、輕-中度損傷、中度損傷及中-重度損傷4組。由于本試驗組評分3分僅12例，4分僅14例，所以，將中-重度和中度損傷組都統(tǒng)一劃分到重度損傷組的范疇內(nèi)。

1.2.3尿KIM-1以及NGAL測定 腎穿刺活檢前1天試驗組患者留取清潔中段晨尿10 mL，對照組在體檢當日清晨留取中段尿10 mL。所有尿液標本留取后在當日室溫下靜置30 min后,于離心機中以1 000 g離心20 min，在過濾掉沉淀物之后，使用無菌管收取上清液，將其儲存在-80 ℃的冰箱內(nèi)等待后期化驗。人KIM-1和人NGAL的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自博士德生物技術(shù)公司。采用ELISA方法檢驗尿液KIM-1以及NGAL的水平，實驗中完全遵循相關(guān)要求展開。

2 結(jié) 果

2.1試驗組不同程度腎小管間質(zhì)損傷組與健康對照組一般臨床資料的比較 試驗組共納入103例CKD患者，其中腎小管間質(zhì)輕度損傷組41例,輕-中度損傷組36例,重度損傷組26例。從年齡、性別這兩項指標上看，健康對照組與不同程度損傷組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2試驗組不同程度腎小管間質(zhì)損傷組各指標的比較 輕度損傷組、輕-中度損傷組和重度損傷組各臨床指標比較發(fā)現(xiàn),清蛋白、三酰甘油等小組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，除此以外，剩余指標的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，伴隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的加重，eGFR水平進行性下降，血肌酐、尿素、胱抑素C水平呈上升趨勢，而血紅蛋白呈下降趨勢,見表2。

表1 試驗組不同程度腎小管間質(zhì)損傷組與健康對照組臨床資料組間比較

表2 試驗組不同程度腎小管間質(zhì)損傷組各指標的比較

注：P、P1、P2、P3分別代表的是單因素方差分析3組間比較、輕度損傷組與輕-中度損傷組比較、輕度損傷組與重度損傷組比較、輕-中度損傷組與重度損傷組比較

2.3健康對照組和試驗組不同程度腎小管間質(zhì)損傷組尿KIM-1和NGAL的水平 尿KIM-1水平不同組別之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但是在輕度損傷組中雖然測定水平較健康對照組有所上升，但是差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而輕-中度損傷組和重度損傷組均較健康對照組明顯上升(P<0.05)，另外不同腎小管間質(zhì)損傷各組比較，僅見重度損傷組較輕度損傷組明顯上升(P<0.05)。而尿NGAL水平在不同組別間差異較為顯著，與健康對照組相比較，在輕度損傷組已經(jīng)出現(xiàn)水平明顯上升，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而且NGAL水平隨著腎小管間質(zhì)損傷程度的加重而明顯上升，僅在輕度損傷組和輕-中度損傷組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 尿KIM-1和尿NGAL水平組間比較

注：與健康對照組間比較，△P<0.05；與輕度損傷組間比較，*P<0.05；與輕-中度損傷組間比較，§P<0.05

2.4尿KIM-1和尿 NGAL水平與臨床指標及腎小管間質(zhì)損傷之間的相關(guān)性分析 進一步分析尿KIM-1和尿NGAL與臨床各項指標及腎小管間質(zhì)損傷程度的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，尿KIM水平與腎功能呈負相關(guān)性，即伴隨著eGFR水平的下降，血肌酐水平和血胱抑素C水平的上升，尿KIM-1水平升高。同樣尿NGAL水平也與腎功能呈負相關(guān)性。另外兩者與血紅蛋白水平均呈負相關(guān)性。在分析兩者與腎小管間質(zhì)損傷程度之間的相關(guān)性時再次證明，尿KIM-1及尿NGAL均與腎小管間質(zhì)損傷程度呈密切的正相關(guān)性，即腎小管間質(zhì)損傷程度越重，尿KIM-1和NGAL水平越高，見表4。

2.5尿KIM-1與尿NGAL對CKD腎小管間質(zhì)損傷及輕度腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線分析 在判斷有無腎小管間質(zhì)損傷的ROC曲線分析中可見,尿KIM-1、尿NGAL的ROC曲線下面積分別為0.88、0.97；二者對應的最佳臨界點為2.13 ng/mL、4.62 ng/mL；前者的靈敏度、特異度分別為80%、88%,而后者的靈敏度、特異度分別為96%、88%。為進一步評估兩個指標在判斷早期腎小管間質(zhì)損傷中的臨床意義，又針對無或有輕度腎小管間質(zhì)損傷進行了ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)尿KIM-1、尿NGAL的ROC曲線下面積分別為0.80、0.94；二者對應的最佳臨界點為2.13 ng/mL、4.62 ng/mL；前者的靈敏度、特異度分別為68%、88%；后者的靈敏度、特異度為95%、88%。見表5。

表4 尿KIM-1和NGAL與其他臨床指標的相關(guān)性分析

表5 腎小管間質(zhì)損傷及輕度損傷的ROC曲線結(jié)果

3 討 論

CKD目前已經(jīng)逐漸成為影響人類健康的重要病因。急性腎損傷可以導致CKD，反之，CKD是急性腎損傷的重要危險因素，各種致病因素導致腎小管上皮細胞損傷而引起無腎小管性腎小球，進而加速了腎臟病的進展，這也提示腎小管間質(zhì)損傷在CKD的進展中具有重要的作用[7-8]。在以腎小球損傷為主的糖尿病腎病的研究中發(fā)現(xiàn),在各種致病因素,如蛋白尿、糖基化終末產(chǎn)物等作用下出現(xiàn)腎小管上皮細胞的損傷，其損傷程度與糖尿病腎病進展密切相關(guān)[9]，而在一項針對原發(fā)性局灶節(jié)段腎小球硬化的研究中同樣提示,腎小管間質(zhì)損傷程度與治療的反應密切相關(guān)[10]。在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變的程度與腎功能呈現(xiàn)密切的正相關(guān)性，即腎小管間質(zhì)病變越重，肌酐水平越高，eGFR水平越低，也再次證明腎小管間質(zhì)病變促進腎臟病的進展。正是因為這些研究結(jié)果使得臨床醫(yī)生在各種原因所致CKD中逐漸關(guān)注腎小管間質(zhì)的損傷，希望尋找敏感的生物標志物便于早期發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)病變，幫助評估疾病進展，指導臨床干預。

目前在臨床中已證實多個生物學標志物在不同的疾病狀態(tài)下能夠反應腎小管間質(zhì)損傷的程度，比如白細胞介素-18、肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-7、尿β2微球蛋白、尿N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶、KIM-1和NGAL等[3]，其中KIM-1和NGAL是比較受關(guān)注的生物標志物。KIM-1是一種在腎小管上皮細胞表達的受體膜蛋白，在正常腎組織不表達，但是當腎小管上皮細胞發(fā)生損傷，如腎毒性急性腎損傷或急性缺血/再灌注損傷，KIM-1在早期就會出現(xiàn)明顯的表達增強[11]。而且KIM-1水平的檢測針對急性腎損傷具有一定的診斷和輔助判斷預后的價值，甚至優(yōu)于血清肌、尿NAG酶等[12-13]。NGAL是最初在激活的中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)的屬于脂質(zhì)運載蛋白超家族的蛋白質(zhì)，同樣在腎小管受到損傷時會在數(shù)個小時內(nèi)表達上調(diào)，早于血肌酐水平的變化[14]。而且近些年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)兩者不但在急性腎損傷中表達明顯增加，在一些CKD伴腎小管間質(zhì)損傷，如IgA腎病、糖尿病腎臟病中同樣具有一定的臨床意義[15-16]。因此，本研究通過在各種原因所致CKD患者中檢測尿液KIM-1和NGAL水平，評估兩者對腎小管間質(zhì)損傷，尤其早期病變的預測價值，為臨床提供指導。在研究中發(fā)現(xiàn)，無論尿KIM-1還是尿NGAL水平均與腎小管間質(zhì)損傷呈密切相關(guān)性，隨著腎小管間質(zhì)病變的加重，兩者水平均呈現(xiàn)上升趨勢，而且在進行相關(guān)分析時也再次證明了這一結(jié)論，與其他研究結(jié)果相同。另外在相關(guān)分析中還提示尿KIM-1和尿NGAL水平同樣與腎功能狀態(tài)呈正相關(guān)性，伴隨著肌酐的升高和eGFR水平的下降，尿KIM-1和NGAL呈現(xiàn)上升趨勢。盡管這個研究僅觀察了在完善腎臟病理時尿KIM-1和NGAL水平與腎功能的相關(guān)性，但是仍然提示兩者的檢測可能幫助預測腎功能的進展和判斷患者的長期預后。實際目前已有研究觀察了KIM-1的檢測在CKD患者中對長期預后的影響。在IgA腎病患者中，尿KIM-1水平與每年eGFR下降呈正相關(guān)性[17]，而且是IgA腎病發(fā)展為終末期腎病的獨立預測因素[18]。在糖尿病腎病的研究中同樣證實KIM-1水平可預測患者進入終末期腎病的風險[19]。因此，根據(jù)本研究的結(jié)果提示,在臨床中可以通過這種無創(chuàng)的檢測方式幫助醫(yī)生更好地判斷患者預后。

為了更進一步評估尿KIM-1和尿NGAL檢測在CKD中對腎小管間質(zhì)損傷的診斷價值，又進一步進行了ROC曲線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在針對是否存在腎小管間質(zhì)損傷中尿KIM-1的ROC曲線下面積為0.88，診斷的靈敏度和特異度分別為80%和88%，而尿NGAL的ROC曲線下面積為0.97，診斷的靈敏度和特異度分別為96%和88%，提示尿NGAL對CKD腎小管間質(zhì)損傷的診斷較KIM-1更特異。實際本研究在觀察不同腎小管間質(zhì)損傷組中尿KIM-1和NGLA的水平時發(fā)現(xiàn)，只有重度損傷組較健康對照和輕度損傷組具有統(tǒng)計學意義的增加，而輕度損傷組尿KIM-1水平較健康對照組僅有2倍左右的增加，且差異無統(tǒng)計學意義。然而，尿NGAL在各組之間差別明顯，輕度損傷組水平已經(jīng)較健康對照組明顯增加，平均值增加近20倍，且隨著腎小管間質(zhì)病變的加重，增加幅度也明顯增多，在重度損傷組較健康對照組增加近100倍，較輕度損傷組也增加近5倍，也支持了尿NGAL對CKD腎小管間質(zhì)損傷的診斷價值優(yōu)于尿KIM-1的說法。由于早期對腎小管間質(zhì)損傷的診斷在臨床中具有重要意義，本研究又分析了針對早期腎小管間質(zhì)病變患者的診斷價值。結(jié)果提示針對是否存在輕度腎小管間質(zhì)損傷尿KIM-1的ROC曲線下面積為0.80，診斷的靈敏度和特異度分別為68%和88%，而尿NGAL的ROC曲線下面積為0.94，診斷的靈敏度和特異度分別為95%和88%，提示尿NGAL對CKD腎小管間質(zhì)損傷的診斷不但特異度優(yōu)于尿KIM-1，靈敏度同樣優(yōu)于KIM-1。雖然兩者在臨床中都被證實在各種腎損傷中能夠反映腎小管間質(zhì)病變，但是有一些研究已經(jīng)提示，在不同的疾病狀態(tài)下兩者的臨床意義有差異，如在高鹽所致大鼠腎損傷模型中伴隨著腎損傷的出現(xiàn)尿NGAL水平明顯升高，但尿KIM-1水平?jīng)]有發(fā)生變化[20]。然而在氨基糖苷類抗菌藥物導致腎毒性損傷模型中發(fā)現(xiàn)尿KIM-1較NGAL是更敏感的指標[4]。在另一項研究中同樣發(fā)現(xiàn)，與尿NGAL相比，大鼠接受低水平的腎毒性藥物即可引起尿中KIM-1水平增高，提示KIM-1針對急性腎損傷是更敏感的生物標志物[21]。根據(jù)本研究的結(jié)果提示，在CKD，尤其是針對各種原發(fā)或繼發(fā)腎小球腎炎所致CKD中，尿NGAL針對腎小管間質(zhì)損傷是更敏感和特異的生物學標志物，可能是臨床更好的選擇。

本研究也存在一些不足，首先，本試驗納入的CKD患者包括各種原發(fā)和繼發(fā)腎小球腎炎，在不同腎小球腎炎類型中尿KIM-1和尿NGAL是否具有同樣的臨床意義尚不能明確。其次，本研究沒有針對患者進行長期的隨訪，不能評估尿KIM-1和NGAL的檢測對患者長期預后的判斷價值。這些也是今后研究的方向。

4 結(jié) 論

尿KIM-1與尿NGAL測定均可以作為評估CKD患者腎小管間質(zhì)損傷程度的標志物，尿NGAL較尿KIM-1對腎小管間質(zhì)損傷程度，尤其針對早期損傷具有更好的評估價值。