九江市2013～2017年新生兒高苯丙氨酸血癥篩查及基因分析

唐軍 謝曉翔 倪龍鳳 陳衍嬌

[摘要]目的 探討九江市新生兒高苯丙氨酸血癥（HPA）的患病率及臨床分型、基因突變特點(diǎn)。方法 選取本市2013年1月～2017年12月出生的新生兒共261 659例作為篩查對(duì)象，使用芬蘭產(chǎn)VICTOR-2D全自動(dòng)免疫熒光儀對(duì)處理后的血斑標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)確診HPA患兒行四氫生物蝶呤（BH4）負(fù)荷試驗(yàn)、尿蝶呤譜分析和紅細(xì)胞二氫蝶啶還原酶（DHPR）活性測(cè)定以鑒別診斷，以Sanger測(cè)序?qū)Ρ奖彼崃u化酶（PAH）基因突變進(jìn)行分析。結(jié)果 篩查261 659例活產(chǎn)新生兒后發(fā)現(xiàn)HPA 24例，患病率1/10 902。24例HPA中，14例（58.3%）苯丙氨酸羥化酶（PAH）缺乏癥（PKU），患病率1/18 689，其中7例（50%）經(jīng)典型苯丙酮尿癥（PKU），2例（14.3%）輕度缺乏PKU，5例（35.7%）BH4缺乏癥，11例患兒接受PAH基因突變分析，其中，9例發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變點(diǎn)，2例發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)12種基因突變。結(jié)論 九江市PAH缺乏癥發(fā)病率低于全國(guó)水平，以經(jīng)典PKU和BH4為主，早期新生兒HPA篩查有利于降低全市出生人口缺陷率。

[關(guān)鍵詞]新生兒；高苯丙氨酸血癥；基因；苯丙氨酸羥化酶缺乏癥

[中圖分類號(hào)] R725.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）12（b）-0068-03

[Abstract] Objective To explore the prevalence rate， clinical typing and gene mutation characteristics of neonatal hyperphenylalanine syndrome （HPA）in Jiujiang City. Methods A total of 261 659 newborns from January 2013 to December 2017 were selected as screening objects. For the diagnosis of hyperphenylalanine， tetrahydrobiological pterine stress test， urine pterine spectrum analysis and erythrocyte dihydropteridine reductase activity were performed， and phenylalanine hydroxylase gene mutation was analyzed by Sanger sequencing. Results After screening 261 659 live newborns， 24 cases of HPA were found， and the prevalence rate was 1/10 902. Among 24 cases of high blood phenylalanine， 14 cases （58.3%） was phenylalanine hydroxylase deficiency（PKU）， the prevalence of 1/18 689， including 7 cases （50.0%） with typical benzene acetone urine disease （PKU）， 2 cases（（14.3%） with lack of mild PKU， 5 cases（35.7%） of BH4 deficiency. 11 patients received PAH gene mutation analysis， 9 cases were found with two point mutations， 2 cases with a mutation point. A total of 12 kinds of genetic mutations was found. Conclusion The incidence of phenylalanine hydroxylase deficiency in Jiujiang City is lower than the national level， mainly including classic PKU and BH4. Screening for early neonatal HPA is conducive to reducing the rate of birth defects in the city.

[Key words] Newborn babies； Hyperphenylalanine； Genes； Phenylalanine hydroxylase deficiency

苯丙酮尿癥（PKU）屬于常染色體隱性遺傳疾病，屬于罕見病，僅影響15 000人中約1人。例如，在美國(guó)，每年約有275例嬰兒患有該疾病[1-2]。由于編碼苯丙氨酸羥化酶（PAH）的基因中有800多個(gè)突變。不同嚴(yán)重程度的突變可引起可變的PAH損傷，導(dǎo)致從輕度高苯丙氨酸血癥（HPA）到經(jīng)典的HPA，對(duì)苯丙氨酸飲食耐受能力也各不相同[3]。如果在新生兒期檢測(cè)到這種情況并開始專門的飲食，則可以避免由PKU引起的嚴(yán)重認(rèn)知障礙。然而，為了使飲食治療有效，必須在生命的最初幾周內(nèi)，在成千上萬的其他未受影響的嬰兒中識(shí)別出具有PKU的嬰兒。在我國(guó)，2016年P(guān)KU的發(fā)病率約為1/15 363，PAH基因突變?cè)谄胀ㄈ巳旱臄y帶率為1/35[4]。我國(guó)于1981年開始進(jìn)行HPA的篩查與治研究，江西九江地區(qū)從2013年開展此項(xiàng)工作。本研究旨在對(duì)九江地區(qū)HPA的患病率、臨床分型進(jìn)行分析研究。

1資料與方法

1.1一般資料

選取本市2013年1月～2017年12月新生兒261 659例活產(chǎn)新生兒的血苯丙氨酸初篩數(shù)據(jù)。充分哺乳的出生3～7 d新生兒經(jīng)知情告知同意后，接產(chǎn)醫(yī)院根據(jù)《新生兒疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范》[5]中要求采足跟血。采血時(shí)間均不超過出生后20 d。所有樣本的采集和檢測(cè)均經(jīng)九江市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并在監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書的情況下完成。

1.2研究方法

使用芬蘭PE公司提供的苯丙氨酸測(cè)定試劑盒（茚三酮熒光法）進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下。①使用打孔器將血斑標(biāo)本依次打入板孔中。②使用移液器在每孔中加15 μl 萃取液，室溫慢速振蕩2 h，放入2～8℃冰箱孵育18～22 h。③每孔加入40 μl去離子水，室溫慢速振蕩20 min，每孔取25 μl轉(zhuǎn)移至反應(yīng)板，并加入50 μl茚三酮試劑，37℃孵育120～140 min。④孵育結(jié)束后每孔加入200 μl銅試劑慢速振蕩5 min，室溫放置3 h后上機(jī)檢測(cè)。

1.3結(jié)果判斷

對(duì)血斑標(biāo)本進(jìn)行處理后，使用配套儀器1420 Victor 2D多標(biāo)記熒光分析儀對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，以檢測(cè)值>陽性切值2 mg/dl視為初篩陽性；對(duì)初篩陽性標(biāo)本行重新采血復(fù)查，結(jié)果仍>2 mg/dl視為篩查陽性，并進(jìn)行鑒別診斷，包括串聯(lián)質(zhì)譜、尿蝶呤譜分析、紅細(xì)胞二氫蝶呤還原酶活性測(cè)定、四氫生物蝶呤（BH4）負(fù)荷實(shí)驗(yàn)、基因檢測(cè)（對(duì)PAH基因外顯子1-13編碼區(qū)及前后10 bp的剪切區(qū)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增并Sanger測(cè)序）。

1.4基因突變檢測(cè)

根據(jù)新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（原衛(wèi)生部2010年版）進(jìn)行分型，新生兒血苯丙氨酸濃度持續(xù)>2.0 mg/dl為HPA。排除BH4缺乏癥后，苯丙氨酸濃度>6.0 mg/dl為經(jīng)典型PKU，血苯丙氨酸≤6.0 mg/dl為輕度PKU。BH4缺乏癥最常見為6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（PTPs）缺乏癥，其次為二氫蝶呤還原酶（DHPR）缺乏癥。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，對(duì)血苯丙氨酸控制濃度與智能發(fā)育水平的關(guān)系采用Bivariate法進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1篩查人數(shù)及陽性病例情況

從2013年1月～2017年12月，我院篩查中心共篩出生的新生兒261 659例，其中HPA 24例，患病率為1/10 902。24例檢出的HPA中，14例（58.3%）為苯丙氨酸羥化酶缺乏癥（PAH），患病率1/18 689，其中7例（50%）經(jīng)典型PKU，2例（14.3%）輕度缺乏PKU，5例（35.7%）BH4缺乏癥。2013～2017年，九江市PKU篩查陽性率分別為1/14 286（2013）、1/10 429（2014）、1/7454（2015）、1/11 447（2016）、1/14 309（2017）、合計(jì)1/10 902。

2.2 11例PHA基因突變情況分析

遵家屬意愿，有11例患兒入組進(jìn)行后續(xù)研究，在這11例PKU患兒中，5例（42.9%）為經(jīng)典型PKU，2例（14.3%）為輕度缺乏，4例（14.29%）為BH4缺乏癥?；蛲蛔兎治霭l(fā)現(xiàn)，PKU患兒檢出錯(cuò)義突變、無義突變、剪接突變及純合突變4種類型，共發(fā)現(xiàn)12種基因突變，其中PKU和HPA患兒基因突變包括E2 c.158G>A、E4 c.395C>T、E6 c.611A>G、E6 C.563delG、E7 c.728G>A、E8 c.907delT、E11 c.1197A>T、E12 c.1222C>T、I4 c.442-1G>A，BH4患兒則檢出3種基因突變E5 c.259C>T、IVS1 c.84-291A>G、IVS3 c.186+1G>A。

3討論

苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，其主要在肝臟內(nèi)PAH的作用下轉(zhuǎn)化成酪氨酸。該途徑由于某種原因受阻或發(fā)生障礙，會(huì)導(dǎo)致苯丙氨酸在體內(nèi)異常蓄積，引發(fā)HPA，過多的苯丙氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨基生成苯丙酮酸等其他代謝產(chǎn)物經(jīng)尿排出，即PKU[6]。1934年，F(xiàn)olling醫(yī)生首次診斷報(bào)道了PKU，1961年美國(guó)Guthrie醫(yī)生建立了PKU的篩查方法即細(xì)菌抑制法，使PKU的新生兒篩查得以實(shí)現(xiàn)[7-8]。我國(guó)從1981年開始在全國(guó)逐步推廣新生兒篩查。九江市于2013年開始PKU的篩查，每年定期進(jìn)行全市采血點(diǎn)質(zhì)量控制檢查和培訓(xùn)。本研究主要對(duì)2013年以來的新生兒進(jìn)行篩查，了解九江市新生兒HPA的患病率及臨床分型、基因突變特點(diǎn)。

PKU是一種常染色體隱性遺傳病，是常見的先天性氨基酸代謝異常疾病，但發(fā)病率因種族及地區(qū)有明顯差異，總發(fā)病率為1∶500～1∶10 000[9]。據(jù)報(bào)道，2016年全國(guó)新生兒篩查HPA的發(fā)率為1/15 363，且北方發(fā)病率高于南方。本研究從出生的261 659例新生兒篩查數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，HPA24例，其中PKU發(fā)病率1/18 689，比例低于全國(guó)平均水平，這可能與九江市人口較少，人口結(jié)構(gòu)比較單一且人口流動(dòng)性不大有關(guān)。

根據(jù)血漿中苯丙氨酸濃度可將PAH缺乏型HPA分為三型[10]：即經(jīng)典型PKU（≥1200 μmol/L），中等型HPA（360～1200 μmol/L），輕型HPA（120～360 μmol/L），其中經(jīng)典型PKU患者病情最重。國(guó)內(nèi)外研究大多數(shù)以經(jīng)典型PKU為主，較少納入輕度HPA[11-14]。本研究發(fā)現(xiàn)HPA24例中，14例（58.3%）PAH，患病率1/18 689，其中7例（50%）PKU，2例（14.3%）輕度缺乏，5例（35.7%）BH4缺乏癥。本研究群體經(jīng)典型PKU占50%，輕度PKU和BH4缺乏癥分別為14.3%和35.7%。并且不同表型組的突變檢出率不同，與舒劍波等[15]的報(bào)道一致；本研究中，11例接受基因檢測(cè)分析患兒中PKU患兒檢出錯(cuò)義突變、無義突變、剪接突變及純合突變4種類型，共發(fā)現(xiàn)12種基因突變，PKU患兒檢出9種占75%；BH4患兒檢出3種基因突變，占25%，共計(jì)12種突變，不過由于檢測(cè)基數(shù)不大，可能存在數(shù)據(jù)的片面性，還需要觀察積累更多的數(shù)據(jù)。

綜上所述，通過新生兒HPA篩查結(jié)果分析可以反映九江市PKU的發(fā)病率及基因型特點(diǎn)，九江市PAH發(fā)病率低于全國(guó)水平，以經(jīng)典PKU和BH4缺乏癥為主。全面積極地開展新生兒疾病篩查對(duì)HPA的早發(fā)現(xiàn)、早治療至關(guān)重要，有利于降低全市出生人口缺陷率，并且隨著新生兒疾病篩查覆蓋率的擴(kuò)大，確定患兒的基因型將有助于臨床醫(yī)師對(duì)不同患者實(shí)施個(gè)體化治療方案，為遺傳咨詢提供幫助。

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