牛樟葉水提物對(duì) D-半乳糖致衰老模型小鼠的作用機(jī)制研究*

張 蓓，余瀟苓，萬永艷，梁學(xué)政，覃開羽△

（1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545026； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

牛樟 Cinnamomum Kanehirae Hayata分布在中國(guó)南部，為臺(tái)灣特有樹種，近年來被中國(guó)大陸地區(qū)多地引進(jìn)栽培。其根、皮、果、葉均可入藥，但功效略有不同，牛樟葉的功效以祛風(fēng)除濕、止痛、殺蟲為主[1]?，F(xiàn)代研究主要以牛樟的無性繁殖、引種栽培、生長(zhǎng)特性和分子鑒定為主[2-3]，藥學(xué)部分僅見牛樟葉精油成分研究，未見藥理和化學(xué)成分的報(bào)道[4]。衰老是生物生命周期的重要組成部分，是任何生命活動(dòng)的必然規(guī)律，雖不可阻滯，但可延遲。隨著世界人口老齡化的加快，探討延緩衰老作用機(jī)制和抗衰老研究已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱門課題之一。自由基理論是衰老機(jī)制的重要理論之一，以氧化應(yīng)激為特點(diǎn)的氧化還原失衡是衰老的重要病理進(jìn)程[5-6]。多糖類物質(zhì)是抗衰老的活性成分[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，牛樟葉富含多糖成分，但尚未闡明牛樟葉多糖延緩衰老的藥效和作用機(jī)制。本研究中建立 D-半乳糖衰老小鼠模型，以抗氧化相關(guān)酶為指標(biāo)，探討了牛樟葉水提物（AECL）的抗衰老作用及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）；ME204E型分析電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.01 mg）；UV1780-5型紫外分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理＜中國(guó)＞有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為240 W，頻率為 40 kHz，轉(zhuǎn)速為 500 ～5 000 r/min）。

試藥：維生素E（桂林南藥股份有限公司，批號(hào)為VE181101）；D-半乳糖（上海惠興生化試劑有限公司，批號(hào)為120214）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)為20190815），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)為 20190414），一氧化氮 （NO）試劑盒（批號(hào)為20181114），總抗氧化能力 （T-AOC）試劑盒（批號(hào)為20190801），過氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號(hào)為20190719），BCA 試劑盒（批號(hào)為 20190815），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。牛樟葉由柳州市天姿園藝有限公司提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊柯教授鑒定為正品，標(biāo)本保存于廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部標(biāo)本室。

動(dòng)物：清潔級(jí) KM 小鼠 60 只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（23±2）℃，相對(duì)濕度 60% ～65% ，明暗 12 h/12 h交替，分籠飼養(yǎng)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 衰老動(dòng)物模型建立

每天于小鼠頸背部皮下注射 D-半乳糖100 mg/kg，連續(xù)造模20 d后，每周周一、周四按相同方法造模2次，共 3 周[8]。

1.2.2 分組及給藥

稱取干燥牛樟葉10 kg，按物料30倍、20倍加水，加熱提取3次，每次3 h，合并3次濾液，常壓加熱，濃縮至流浸膏，分裝，4℃冰箱冷藏保存，備用，流浸膏1 g相當(dāng)于8.805 g牛樟葉，即得AECL。取造模后10 d的KM小鼠，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即模型組（B組），陽性對(duì)照組（C 組，維生素 E，200mg/kg），AECL 高、中、低劑量組[D1組、D2組、D3組，給藥劑量相當(dāng)于每1kg體質(zhì)量20，10，5 g（生藥）]，每組 10 只；另取 10 只同批健康 KM種小鼠，雌雄各半，作為正常對(duì)照組（A組）。C組和D1，D2，D3組灌胃給藥，每日2次，連續(xù)30 d，A組和B組給予等體積生理鹽水。末次給藥2 h后，摘取眼球取血，分離血清，立即處死動(dòng)物，剖取肝臟、心臟、腎臟、腦。

1.3 觀察指標(biāo)

分離血清和肝、心、腎、腦組織勻漿后，嚴(yán)格按試劑盒說明書方法檢測(cè)相應(yīng)組織器官的SOD，GSH-Px，CAT，T-AOC，NO 水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

D-半乳糖干預(yù)5周后，小鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，皮毛逐漸無光澤和變灰色，體質(zhì)量逐漸下降，表現(xiàn)出明顯的衰老特征。與A組比較，B組小鼠血清中SOD，GSH-Px，T-AOC水平均明顯下降（P＜0.05），表明成功構(gòu)建D-半乳糖衰老小鼠模型。與B組比較，C組、D1組、D2組小鼠血清中SOD和GSH-Px水平均明顯升高，C組、D1組 SOD，GSH-Px，T-AOC水平差異均顯著升高（P ＜0.05）。詳見表 1。

表1 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of AECL on blood biochemical indexes of D-galactose-induced aging mice（±s，n=10）

表1 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s，n=10）Tab.1 Effect of AECL on blood biochemical indexes of D-galactose-induced aging mice（±s，n=10）

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組比較，*P＜0.05。下表同。Note：Compared with those in group A，#P ＜ 0.05；compared with those in group B，*P ＜ 0.05；as well as the following tables.

組別 劑量（g/kg）SOD（U/mL）GSH-Px（U）T-AOC（mmol/L A組B組C組D1組D2組D3組0.20 20 10 5 16.16±3.36 12.13±2.62#16.40±4.22*15.32±3.12*14.65±3.03*11.52±2.03 240.17±31.43 215.69±19.07#243.97±36.23*233.28±17.22*236.72±28.67*236.72±32.69）2.83±0.06 2.73±0.09#2.82±0.06*2.80±0.06*2.73±0.09 2.69±0.06

表2 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠肝臟、心臟SOD和CAT及腎臟SOD的影響（±s，U/μg pro，n=10）Tab.2 Effect of AECL on the levels of SOD and CAT in liver and heart，the level of SOD in kidney of D-galactose-induced aging mice（±s，U/μg pro，n=10）

表2 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠肝臟、心臟SOD和CAT及腎臟SOD的影響（±s，U/μg pro，n=10）Tab.2 Effect of AECL on the levels of SOD and CAT in liver and heart，the level of SOD in kidney of D-galactose-induced aging mice（±s，U/μg pro，n=10）

組別 劑量（g/kg） 肝組織 心臟 腎臟SOD A組B組C組D1組D2組D3組0.20 20 10 5 SOD 27.85±1.23 21.43±2.58#26.69±2.60*29.91±1.69*32.24±2.26*32.34±2.48*CAT 197.87±92.93 113.22±34.21#221.58±86.01*215.46±110.43*220.19±135.48*220.79±130.33*SOD 35.43±18.00 20.13±11.51#39.14±25.96*42.69±36.92 80.14±79.91*30.13±19.39 CAT 93.91±44.58 56.66±48.07 103.71±59.18 138.33±86.22*128.08±107.45 64.56±51.14 321.25±54.42 259.05±41.77#294.45±34.87 305.35±35.60*296.29±33.48*287.31±39.7

2.2 對(duì)肝臟SOD和CAT的影響

與A組比較，B組小鼠肝組織勻漿中SOD和CAT活性均明顯降低（P＜0.05），表明 D-半乳糖衰老小鼠肝臟抗氧化能力下降；與B組比較，C組、D1組、D2組、D3組小鼠肝組織勻漿中SOD和CAT水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 對(duì)心臟SOD和CAT水平的影響

與A組比較，B組小鼠心臟組織勻漿中SOD水平明顯降低（P＜0.05），CAT水平有降低趨勢(shì)，但無顯著差異（P＞0.05）；與B組比較，C組、D2組小鼠心臟組織勻漿中SOD水平均顯著升高（P＜0.05），D1組CAT水平顯著升高（P＜0.05），表明AECL能顯著提高衰老小鼠心臟的抗氧化能力。詳見表2。

2.4 對(duì)腎臟SOD的影響

與A組比較，B組小鼠腎臟組織勻漿SOD水平明顯降低（P＜0.05）；與B組比較，D1組、D2組小鼠腎臟組織勻漿中SOD水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.5 對(duì)腦組織SOD，GSH-Px，NO的影響

與A組比較，B組小鼠腦組織勻漿中SOD，GSH-Px，NO水平均明顯降低（P＜0.05）；與B組比較，C組、D1組小鼠腦組織勻漿中NO水平均顯著升高（P＜0.05），SOD和GSH-Px水平均呈升高趨勢(shì)，但無顯著差異（P ＞0.05）。詳見表 3。

表3 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠腦組織指標(biāo)影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of AECL on brain tissue indexes ofD-galactoseinduced aging mice（±s，n=10）

表3 AECL對(duì) D-半乳糖衰老小鼠腦組織指標(biāo)影響（±s，n=10）Tab.3 Effect of AECL on brain tissue indexes ofD-galactoseinduced aging mice（±s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量（g/kg）0.20 20 10 5 SOD（U/μg pro）42.30±2.55 28.65±9.24#33.53±7.95 33.14±7.52 32.17±7.80 33.68±7.98 GSH-Px（活力單位 /μg pro）148.48±50.52 104.37±29.65#136.65±46.81 123.37±30.61 117.79±39.50 112.19±40.19 NO（μmol/L）14.21±8.96 6.64±5.46#23.32±12.04*16.03±8.06*10.07±7.60 10.32±6.01

3 討論

研究表明，機(jī)體衰老與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，生化指標(biāo)測(cè)定一般多集中在氧化應(yīng)激相關(guān)酶的測(cè)定[9]。SOD，CAT，GSH-Px可清除超氧陰離子，維持機(jī)體氧化還原平衡[10]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，藥物干預(yù)組動(dòng)物血清的 T-AOC，SOD，CAT，GSH-Px生化指標(biāo)均明顯改善，表明AECL有抗衰老作用。SOD調(diào)節(jié)活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）的水平，減少對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的損害[11]。本研究中，AECL明顯提高衰老模型小鼠肝臟、腎臟和心臟勻漿的SOD水平，加快ROS的清除，維持機(jī)體的氧化還原平衡。CAT負(fù)責(zé)將SOD催化生成的過氧化氫轉(zhuǎn)化成氧分子，降低過氧化氫濃度，促進(jìn)超氧陰離子的清除[12]。本研究中，AECL處理后，衰老模型小鼠心臟和肝臟勻漿的CAT水平明顯升高，抗氧化能力增強(qiáng)。NO可通過隔離鐵離子的方式發(fā)揮抗氧化作用[13]，可通過調(diào)節(jié)SOD活性發(fā)揮抗氧化作用[14]。AECL可提高心臟SOD水平，D2組小鼠SOD水平明顯高于D1組和D3組。由于中藥具有多靶點(diǎn)、多組分的特點(diǎn)，各活性成分間又存在協(xié)同作用及拮抗作用。因此，量效曲線可能呈鐘形曲線。AECL處理 D-半乳糖衰老小鼠后，小鼠腦組織勻漿中NO水平明顯上升，AECL的抗衰老作用可能與提高腦組織NO水平有關(guān)；腦組織勻漿中SOD和GSH-Px水平并未顯著改善，但影響心臟和腎臟中SOD水平，肝臟、心臟勻漿CAT水平及腦組織勻漿中NO水平的詳細(xì)作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，AECL具有一定的延緩衰老作用，其作用機(jī)制可能與提高肝臟、心臟、腎臟和腦組織的抗氧化能力有關(guān)，但詳細(xì)作用機(jī)制需要作進(jìn)一步探討。