豬流行性腹瀉病毒安徽分離株ORF3基因的克隆與序列分析

潘孝成，沈?qū)W懷，趙瑞宏，胡曉苗，戴 銀，周學(xué)利，侯宏艷，張丹俊

（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，其可導(dǎo)致豬的一種以水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的傳染病。1971年首次在英國(guó)發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）[1]，我國(guó)內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初以來(lái)陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報(bào)道[2]。2010年底開(kāi)始，PED在我國(guó)呈暴發(fā)性流行，流行面較廣，主要表現(xiàn)為各年齡段豬均可發(fā)生腹瀉，成年豬一般只表現(xiàn)為腹瀉癥狀，小豬死亡率高，10日齡仔豬死亡率可達(dá)100%，給眾多養(yǎng)豬場(chǎng)（戶）帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。PEDVORF3基因由675個(gè)核苷酸組成，編碼224個(gè)氨基酸，是一種非結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明ORF3基因與PEDV的毒力相關(guān)[5]。本研究對(duì)PEDV安徽分離株的ORF3基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列分析，以期為PED的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料

RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶、pMD-18T載體等購(gòu)自TakaRa公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α、DNA Marker等購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）的抗原快速檢測(cè)試劑盒（膠體金試劑）購(gòu)自BioNote公司。

1.2 病料

病料樣品為刮取的腸道黏膜，采自安徽省境內(nèi)疑似發(fā)生豬流行性腹瀉的豬場(chǎng)（2013年12月至2014年6月），發(fā)病仔豬臨床表現(xiàn)為水樣腹瀉，腸道出血，用PEDV、TGEV和PoRV的膠體金抗原快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，結(jié)果為PEDV陽(yáng)性，TGEV和PoRV均為陰性。從膠體金試劑檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性的樣品中，選擇了不同地區(qū)8個(gè)有代表性的豬場(chǎng)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，這8個(gè)豬場(chǎng)分別來(lái)自肥東縣、廣德縣、合肥市包河區(qū)、和縣、壽縣、六安市金安區(qū)、利辛縣、定遠(yuǎn)縣。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PEDV的ORF3基因序列，設(shè)計(jì)了 1 對(duì)引物，P1（5'-3'）：AAGGTCCACG TGCAGTGATGT，P2（5'-3'）：TACTAGACCATTATCA TTCAC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增705 bp基因片段長(zhǎng)度，包含PEDVORF3基因全長(zhǎng)。

1.4RNA提取及cDNA合成

刮取發(fā)病仔豬小腸黏膜層，按TakaRa公司RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用TakaRa公司1st Strand cDNA Synthesis kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增

以合成的cDNA為模板，用引物對(duì)P1/P2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：cDNA 3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上下游引物（P1/P2）各 1 μL（10 pmol/μL），Ex-Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 15 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃50 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。電泳鑒定為陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)入DH5α，鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.6 基因序列分析

采用 DNA Star、DNAMAN、Genetyx 等軟件，將擴(kuò)增序列與GenBank中的13個(gè)PEDV分離株的ORF3基因序列進(jìn)行序列比對(duì)、同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。所用參考毒株序列見(jiàn)表1。

表1 參考株相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

取豬流行性腹瀉病毒膠體金抗原檢測(cè)試劑檢測(cè)為陽(yáng)性的，且來(lái)自安徽省不同地區(qū)8個(gè)豬場(chǎng)的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的基因片段大小均約為705 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PEDV ORF3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 基因測(cè)序與同源性分析

經(jīng)測(cè)序，證實(shí)獲得了包含8個(gè)豬流行性腹瀉病毒分離株ORF3基因全長(zhǎng)的序列，ORF3基因全長(zhǎng)均為675 bp，編碼224個(gè)氨基酸，分別命名為AH-FD、AH-GD、AH-SD、AH-HX、AH-SH、AH-LA、AHYD、AH-FX，其中 AH-FD、AH-GD、AH-SD 和 AHHX 為 2013年流行株，AH-SH、AH-LA、AH-YD 和AH-FX為2014年流行株。應(yīng)用DNA Star等軟件，將8個(gè)豬流行性腹瀉病毒分離株及參考毒株的ORF3序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示，8個(gè)豬流行性腹瀉病毒分離株的ORF3序列同源性為98.5%～100%，其中AH-GD和AH-FD及AH-HX和AH-SH的基因核苷酸序列完全相同（數(shù)據(jù)未列出），后面只分析6個(gè)分離株（AH-FD、AH-SD、AHSH、AH-LA、AH-YD和 AH-FX）的ORF3基因。本研究獲得的6個(gè)豬流行性腹瀉病毒分離株與attenuated DR13、CH-BJ-2011 truncated、CV777、LZC、CHS-2009的同源性相對(duì)較低，分別為97.4%～98.1%、97.0%～97.6%、96.4%～97.0%、95.1%～95.7%和97.8%～98.7%，同源性最低的是AH-FX和LZC（95.1%）；與 AH2012、CH-HNZMD-2015、CH-JXJA-2017、MN-2013-USA、SC-CD-2015、SCDY-2016、USA-OK10240-6-2017和ZJU-G2-2013的同源性相對(duì)較高，分別為98.2%～99.7%、98.7%～99.6%、98.8%～99.9%、99.0%～100%、99.1%～99.7%、98.8%～99.9%和99.1%～99.6%，同源性最高的是AH-LA和2013年美國(guó)分離株MN-2013-USA（100%），詳見(jiàn)圖2。

圖2 PEDV ORF3基因的核苷酸序列同源性比較

2.3 序列進(jìn)化分析

通過(guò)對(duì)6個(gè)分離株（AH-FD、AH-SD、AH-SH、AH-LA、AH-YD 和 AH-FX）與參考毒株（CV777、AH2012、LZC、attenuated DR13、MN-2013-USA）的ORF3基因氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這6個(gè)分離株的ORF3氨基酸序列與MN-2013-USA和AH2012高度相似，僅存在0～4個(gè)氨基酸不同，其中AH-FD、AH-SD和AH-LA與MN-2013-USA的氨基酸序列相同；與疫苗毒attenuated DR13相比，在81～82位，多了17個(gè)氨基酸；與LZC和CV777差異較大，存在7～13個(gè)氨基酸不同，具體見(jiàn)圖3。

基于ORF3基因的核苷酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示（圖4），PEDV毒株可分為3大群，Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群，Ⅰ群包括CV777和LZC；Ⅱ群包括CHBJ-2011 truncated和attenuated DR13，Ⅲ群包括本研究得到的6個(gè)安徽分離株、2009年我國(guó)分離的CHS-2009以及2012年以來(lái)我國(guó)的6個(gè)分離株（AH2012、CH-HNZMD-2015、CH-JXJA-2017、SC-CD-2015、SCDY-2016和ZJU-G2-2013）和美國(guó)的兩個(gè)分離株（MN-2013-USA和 USA-OK10240-6-2017）。這表明，6個(gè)分離株（AH-FD、AH-SD、AH-SH、AH-LA、AH-YD和AH-FX）與疫苗株（CH-BJ-2011 truncated和attenuated DR13）、經(jīng)典毒株CV777和我國(guó)2006年分離株LZC株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 PEDV ORF3氨基酸序列比較

圖4 PEDV ORF3基因的核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)

3 討論

豬流行性腹瀉病毒的ORF3基因是其基因組中的唯一附屬基因，基因全長(zhǎng)為675 bp，分子量為25.3 kDa，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3蛋白，因其位于S蛋白和E蛋白之間，又稱為SNE（Spike and Envelope，SNE）蛋白。通過(guò)對(duì)野生毒株和人工致弱毒株的ORF3序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)傳代致弱的疫苗株均有51個(gè)核苷酸（17個(gè)氨基酸）的缺失，因此被認(rèn)為是毒力相關(guān)基因[5-6]。本研究獲得了8個(gè)PEDV分離株的ORF3基因全長(zhǎng)序列，這8個(gè)分離株分別是2013年和2014年的安徽流行株，序列比對(duì)結(jié)果顯示，8個(gè)PEDV分離株的ORF3核苷酸序列高度同源（同源性為98.5%～100%），且與疫苗株相比均不存在17個(gè)氨基酸的缺失；且與參考毒株中2011年后的中國(guó)及美國(guó)分離株存在較高同源性（98.2%～100%），同源性最高的是AH-LA和2013年美國(guó)分離株MN-2013-USA（100%），同源性次高的是AH-LA和CH-JXJA-2017、AH-LA 和 USA-OK10240-6-2017及 AHHX、AH-SH、AH-SD、AH-YD 與 MN-2013-USA（99.9%）；與疫苗株（attenuated DR13、CH-BJ-2011 truncated）及CV777和LZC的同源性較低（95.1%～98.1%）。綜上推測(cè)，2011年以來(lái)中國(guó)PEDV流行毒株有相同的毒株來(lái)源；2011年至今中國(guó)PEDV流行毒株無(wú)較大變異；美國(guó)的PEDV流行毒株與中國(guó)分離株，特別是安徽分離株關(guān)系親密，可能存在相同的毒株來(lái)源，這與Huang等[7]的分析相一致。

自2010年冬季我國(guó)暴發(fā)豬流行性腹瀉病以來(lái)，該病迅速傳遍全國(guó)，2013—2014年豬流行性腹瀉更是肆虐全球，美國(guó)、墨西哥、中國(guó)臺(tái)灣、日本、加拿大、多米尼加共和國(guó)、哥倫比亞、秘魯、韓國(guó)、烏克蘭等國(guó)家和地區(qū)也相繼報(bào)道發(fā)生豬流行性腹瀉疫情[7-8]，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重災(zāi)難，是近年來(lái)全球養(yǎng)豬業(yè)關(guān)注的疫病焦點(diǎn)。由于現(xiàn)有豬流行性腹瀉疫苗的免疫效力不足，加之豬場(chǎng)環(huán)境及豬舍衛(wèi)生消毒不徹底，豬流行性腹瀉病毒在豬場(chǎng)污染嚴(yán)重，難以清除。因此，豬流行性腹瀉已成為豬場(chǎng)的常發(fā)病，在天氣多變的秋季和寒冷的冬春季節(jié)仍將流行[9]。2014年以來(lái)，豬流行性腹瀉病的疫情一直比較平穩(wěn)，但仍在一些地區(qū)的不少豬場(chǎng)發(fā)生，雖然在大多數(shù)發(fā)病豬場(chǎng)的流行時(shí)間較前些年有縮短的趨勢(shì)、發(fā)病的嚴(yán)重程度也有較大降低，可其危害仍不容忽視，需要在養(yǎng)豬生產(chǎn)中給予足夠的關(guān)注。